qPCR en el estudio de la modulación de enzimas metabolizantes por el plaguicida organofosforado clorpirifos

SANCHEZ VICTORIA GUADALUPE; GUIÑAZÚ NATALIA

Neuquén

Jornada; II Jornadas de Investigación y Posgrado; 2015

Facultad de Ingeniería, UNCOMA

La Placenta posee funciones metabólicas y endócrinas que pueden ser afectadas por compuestos endógenos y exógenos presentes en la circulación materna. Ésta expresa algunas enzimas citocromo P450 (CYP). Las mismas son responsables de la síntesis y el metabolismo de hormonas esteroides, tales como estrógeno y progesterona, y además poseen un rol central en el metabolismo de xenobióticos. Las familias CYP1, 2 y 3, han sido reportadas como las más relevantes en los mecanismos de detoxificación o bioactivación de drogas y tóxicos. Enzimas de estas familias, incluyendo CYP1A2, CYP3A4, 2D6, CYP2B6 y CYP 2C19, se expresan en la placenta humana. Sin embargo, su expresión no ha sido estudiada en líneas celulares de trofoblastos.Los objetivos del presente trabajo fueron: ?Estudiar la expresión basal de enzimas CYP importantes para el metabolismo de xenobióticos en células trofoblasticas JEG-3.?Poner a punto la técnica de PCR en tiempo real (qPCR), para el estudio de la modulación de la expresión de CYP en dicha línea celular, por el plaguicida clorpirifos. Se estudió la expresión basal de las enzimas CYPs 1A2, 3A4, 2D6, 2B6 y 2C19 por RT-PCR convencional y se encontró que, a excepción de CYP 2D6, todas se expresan. Para el estudio del segundo objetivo propuesto, las células se incubaron con diferentes concentraciones de Cp durante 8 y 24 hs. Se extrajo el ARN de las células y se preparó el ADNc por transcripción inversa. La secuencia de los primers específicos, para la amplificación selectiva de cada CYP, fueron extraídos de la bibliografía y chequedos con el programa OLIGO Explorer online 1.0 beta. Se utilizó el sistema de detección SYBR Green y por el método de cuantificación relativa ∆∆Ct se determinaron los niveles de inducción de los RNAm de las CYP.La técnica de qPCR es rápida, sensible, y permitió medir con precisión la cantidad de ARNm específico para CYP 3A4, 2B6 y 2C19. La aplicación de este método puede resultar en una reducción drástica del tiempo necesario para el screening de xenobióticos que pueden actuar como inductores enzimáticos. Si bien el contenido de RNAm podría ser correlacionado con el contenido de proteínas y por ende con la actividad enzimática. Ésta actividad no sólo es atribuible a la regulación transcripcional, por lo que su correlación con el contenido de ARNm debe ser establecido experimentalmente.