LA PRODUCCIÓN DE XILANASAS POR Pseudobutyrivibrio xylanivorans CONFIRMA EL POTENCIAL FIBROLÍTICO DE ESTE FUTURO PROBIÓTICO

RUIZ S; GIMENEZ, MC; ARENAS, GN; SOHAEFER N; PEREYRA L; PEREYRA C; GAIA, A; GONÇALVES, C; SECHOVCOVÁ, H; MRAZEK J; GRILLI, D

Mendoza

Jornada; X Jornadas de Investigación de la Universidad Juan Agustín Maza; 2018

Universidad Juan A Maza

Recientemente, nuestro equipo logró aislar una bacteria de la especie Pseudobutyrivibrio xylanivorans (cepa 2) a partir del contenido ruminal de cabras Criollas. En esta cepa, se identificaron los genes que codifican para xilanasas involucradas en la degradación de la fibra vegetal. La caracterización de las enzimas fibrolíticas producidas por P. xylanivorans 2, mediante enzimogramas y la determinación de su actividad enzimática, confirmarían el potencial fibrolítico de esta cepa para ser utilizada como probiótico. Para confirmar estos resultados se compararon los resultados obtenidos con la cepa de referencia (P. xylanivorans Mz5). Por lo tanto, ambas cepas se cultivaron anaeróbicamente a 38 °C en un medio líquido sin fluido ruminal que contenía 0,5% de xilano o 0,2% de glucosa. Las bacterias se cosecharon después de un crecimiento de 5 días, mediante centrifugación a 3000 rpm y se lavaron con buffer fosfato de sodio (50 mM, pH = 6,5). El sobrenadante se filtró a 10 °C utilizando una membrana Millipore y se almacenó inmediatamente a -20ºC. El pellet bacteriano (o fracción celular) se conservó en esta misma temperatura. La actividad xilanasa de ambas cepas se determinó espectrofotométricamente en las fracciones celulares (endoxilanasas) y sobrenadantes (exoxilanasas), utilizando 0,5 % de xilano en buffer fosfato de sodio a 37 °C. Las concentraciones de azúcares reductores se determinaron después de la incubación de las muestras con el sustrato, a 37 °C durante 150 minutos, de acuerdo con el método descripto por Lever. Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida utilizando SDS (SDS-PAGE) y detección visual de la actividad xilanolítica, se realizó el análisis funcional de la capacidad de degradación del xilano por ambas cepas. Para ello, después de la centrifugación de los cultivos, las proteínas celulares y las proteínas sobrenadantes se separaron mediante SDS-PAGE. Las muestras se incubaron durante 10 min a 80 °C antes de ejecutar el gel. El procedimiento para realizar los xilanogramas fue el mismo utilizado para realizar SDS-PAGE convencional, adicionando un 0,5% de xilano al gel separador. Después de la electroforesis, las enzimas se renaturalizaron en buffer Tris HCl 50 mM (pH = 6,8) y mercaptoetanol 5 mM con EDTA 1 mM. Las proteínas con actividad xilanolítica se detectaron como zonas ?aclaradas? después de la re-naturalización, incubación y tinción del gel con solución alcalina de rojo Congo (Sigma). Los pesos moleculares de las enzimas se determinaron con marcadores de proteínas (BioLabs, New England). Los resultados muestran en ambas cepas una endoxilanasa constitutiva de 45 kDa, cuya actividad xilanolítica específica fue 50 ug/mL/h, duplicada (100 ug/mL/h) luego de la inducción generada por la presencia de xilano. Se identificaron exoxilanasas de 45 a 58 kDa en ambas cepas que fueron inducidas por la presencia de xilano. A partir de estos resultados se puede concluir que P. xylanivorans 2 expresa su actividad xilanolítica máxima en presencia de xilano y confirma el potencial fibrolítico de este futuro probiótico.