Descripción comparativa de coloraciones en el ensayo de micronúcleos-citoma bucal en caninos.

CARRACEDO R; CALIRI M; D. M. FERRÉ,; PEDROSA A; LENTINI V; N GORLA,

Congreso; CONGRESO VETERINARIO DE LEÓN EN ARGENTINA; 2023

El perro es actualmente una especie sugerida para realizar estudios de toxicología genética en biomonitoreos sobre el efecto de la contaminación ambiental a distintos niveles de organización biológica (Backer et al., 2001); y además, este modelo podría jugar un papel importante en la evaluación de productos químicos, incluido fármacos y la evolución de un tratamiento, con proyección aplicable al hombre. En este sentido, una de las ventajas de realizar investigación biomédica en caninos, es que estos animales de compañía y las personas comparten gran parte del medioambiente con los contaminantes allí presentes, hábitos, consumo de agua del mismo origen y calidad, alimentación, y existen similitudes en las prácticas médicas y tratamientos farmacológicos. En consideración de que los epitelios son el blanco de exposición y vía de ingreso de muchos fármacos y contaminantes, el objetivo del estudio fue identificar las características distintivas de la coloración de Giemsa y la reacción de Feulgen, aplicadas al ensayo de micronúcleos citoma (MN- cit) bucal en células exfoliadas de la mucosa oral, en términos de ventajas y facilidades de uso en la práctica veterinaria. Se realizó el análisis citológico a partir de muestras de mucosa bucal obtenida por raspaje con mini- espátulas de 6 caninos adultos sanos raza ovejero alemán de 3 a 6 años de edad del Cuerpo de Canes “Sgto. Ramón González” de la policía de Mendoza, los cuales no habían recibido medicación durante 2 meses previos a la toma de muestra. Las muestras se fijaron con metanol: ácido acético (3: 1) durante 10 minutos, se extendieron en portaobjetos y se dejaron secar al aire por un mínimo de 24 h. Los extendidos se colorearon con la reacción de Feulgen, según Thomas et al., 2009 con modificaciones. La observación se realizó en forma secuencial por microscopía óptica y luego por microscopía de fluorescencia mediante el uso de microscopio de epifluorescencia Nikon E200, con lámpara de vapor de mercurio HB100. Posteriormente, se enjuagaron los extendidos con agua destilada y se colorearon con Giemsa (Merk) la cual se preparó al 10% en agua corriente y se colocaron las muestras durante 9 min. Luego fueron lavadas con agua corriente y se dejaron secar a temperatura ambiente para ser observadas por microscopía óptica en un microscopio Nikon Eclipse E100. En un total de 2.000 células analizadas por individuo (1.000 células coloreadas con Giemsa y 1.000 con reacción Feulgen), se analizaron las variables cualitativas de distinción diferencial del núcleo y citoplasma, presencia de artificios citoplasmáticos, morfología de células basales y diferenciadas, coloración de células indicadoras de muerte celular: con cromatina condensada, cariorrexis, cariolisis y picnosis; y coloración de células con anormalidades nucleares: micronúcleos (MN) y brotes nucleares.Una de las características únicas de la coloración Feulgen, es que es una reacción nuclear donde el ADN se observa como color rojo brillante bajo fluorescencia con un filtro rojo, lo que permite distinguir límites precisos entre núcleo y citoplasma. La textura nuclear, que es esencial en la clasificación de cromatina condensada y las células cariorréxicas, se expone en forma clara bajo la observación con un microscopio de fluorescencia, en coincidencia con Thomas et al., 2009. Mediante esta reacción ADN específica, se pueden distinguir de manera más precisa las alteraciones nucleares y los MN con evidente contraste entre el núcleo y el citoplasma por el verde brillante bajo observación con microscopio óptico (figura 1), como también han reportado otros autores (Esteves et al., 2018). Esta coloración permite examinar de manera secuencial los extendidos citológicos, tanto por microscopía óptica como de fluorescencia, para confirmar las sospechas o falta de definición respecto a la clasificación celular que pudieran haber surgido durante la observación por microscopía óptica (figuras 2, 3 y 4). Esta ventaja disminuye las probabilidades de falsos positivos, ya que no se colorean estructuras como bacterias, como sucede con la coloración Giemsa. Además, la observación es más rápida, así como también más sencilla respecto de esta última coloración. La coloración Giemsa es ampliamente utilizada en citogenética por tener afinidad a zonas ricas de Adenina y Timina en la cromatina (Wong, 2016). Es un método rápido (15 min), sencillo de preparar al ser de un solo paso, su costo es relativamente bajo y tiene menos soporte de infraestructura en comparación con la coloración Feulgen (Dilleswari, 2018; Esteves et al., 2018; Metgud, 2017). Requiere una fijación celular de tan solo minutos. En caso de exceso en la intensidad de la coloración se puede decolorar y volver a colorear.Se determinó que, si no se utiliza un reactivo de Schiff de excelente calidad, como una marca de alta gama, en la coloración de Feulgen los núcleos se observan excesivamente claros, lo que imposibilita la distinción de algunos detalles nucleares, como los MN de tamaño pequeño y grados leves de condensación de la cromatina nuclear (figuras 5 y 6). Cuando las células presentan detritus, bacterias o gránulos de queratohialina, si bien no se colorean, mediante la observación en fluorescencia pueden ser interpretados como grados de condensación o cariorréxis según la cantidad de los mismos ya que se observan sombras oscuras en el citoplasma. Los artefactos de la coloración, que se originan al usar un reactivo de baja calidad o en malas condiciones, brillan a la fluorescencia por lo que pueden confundirse con MN. Es un método que insume más tiempo (aproximadamente 3 a 4 h) y económicamente implica un gasto alto entre insumos (frascos Coplin, agua ultrapura, microscopio de epifluorescencia, cámara de extracción para manipular HCl, reactivo de Schiff y colorante verde brillante). En caso de exceso de verde brillante en el extendido, éste no permite observar el núcleo y no se puede decolorar para volver a colorear. En Giemsa las bacterias que contaminan el extendido se tiñen de violeta, por lo que es posible su confusión con un MN resultando en falsos positivos al momento del análisis cuantitativo de anormalidades nucleares indicadoras de daño genético, tal como se ha reportado Esteves et al. (2018). También colorea artificios con las mismas consecuencias. La observación de los extendidos requiere de mayor tiempo. En concordancia con otros autores, se considera que el uso de diferentes coloraciones, y distintos protocolos de trabajo para una misma coloración pueden contribuir a grandes variaciones encontradas por los diferentes laboratorios, principalmente en relación al color y contraste (Bolognesi et al., 2013; Esteves et al., 2018; Grover et al., 2012; Pai et al., 2012 y Ramirez, 2002).Como conclusión, para realizar una evaluación del daño al material genético se recomienda realizar un estudio citológico con la reacción Feulgen, siempre que pueda utilizarse un reactivo Schiff de excelente calidad. La coloración Feulgen presenta como desventaja que requiere de mayor tiempo y elevado costo en comparación con la coloración Giemsa. Respecto a esta última, presenta como ventaja la realización en forma sencilla en un solo paso, con una duración de 15 min, además de ser económico, a fin de realizar monitoreos que implican un análisis secuencial en el tiempo. Ambas coloraciones son útiles, además, para evaluar citotoxicidad o muerte celular en caninos.