Neutralización de la actividad hemorrágica del veneno de Botrhops alternatus con anticuerpos anti-baltergin

GAY CLAUDIA C.; RUIZ, RAQUEL M.; MARUÑAK SILVANA L.; LEIVA LAURA C.; ACOSTA DE PÉREZ, OFELIA

Corrientes

Otro; Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2008. http://www.unne.edu.ar/investigacion/com2008/E-113.pdf; 2008

Secretaría General de Ciencia y Técnica - UNNE

El envenenamiento por serpientes del género Bothrops es una causa frecuente de accidentes en varias regiones de nuestro país. En el noreste argentino, una de de las principales especies involucrada es Bothrops alternatus. Su veneno constituye una rica fuente de proteínas que ejercen diferentes actividades deletéreas, tales como trastornos en la coagulación, proteólisis de tejidos y hemorragia. Esta última es una manifestación muy frecuente y es inducida por proteasas metal dependiente. En trabajos previos de nuestro laboratorio se ha aislado y caracterizado bioquímicamente una metaloproteinasa de este veneno, llamada baltergin, con importante actividad hemorrágica en ratón, tanto a nivel local como sistémico. En el presente trabajo se ensayó la capacidad neutralizante de la actividad hemorrágica de anticuerpos anti-baltergin sobre veneno entero, obtenidos y purificados a partir de suero de conejo inmunizado. La hemorragina fue aislada a partir de 40 mg de veneno utilizando dos columnas cromatográficas: intercambio iónico y filtración por gel. Su pureza fue controlada por SDS-PAGE. Los anticuerpos anti-baltergin se obtuvieron inmunizando conejos por vía intramuscular y subcutánea con 0,1 mg de proteína siguiendo un protocolo de 45 días, al cabo del cual se sangró el conejo. Durante la inmunización se controló el título de anticuerpos específicos en el suero por ELISA. Para purificar los anticuerpos, el suero fue precipitado con solución saturada de sulfato de amonio, la fracción precipitada (que contiene las inmunoglobulinas) fue disuelta y sometida a diálisis frente a tampón de fosfatos pH 8. Se completó la purificación de IgG por cromatografía de intercambio iónico. A partir de esta fracción se ensayó la neutralización de la actividad hemorrágica del veneno entero en ratones mediante test de la piel de Kondo. Una dada cantidad de veneno (7,2 μg; correspondiente a 2 veces la dosis hemorrágica mínima) se preincubó (37 ºC - 30 min) con diferentes cantidades de anti-baltergin (30 a 800 μg) en PBS. Con 100 μl de estas mezclas se inocularon intradérmicamente ratones y a las 2 h se midieron los halos hemorrágicos. Ratones controles fueron inoculados con veneno (7,2 μg). Se comprobó que 252 μg de anticuerpos fue la menor cantidad necesaria para neutralizar el halo generado por 7,2 μg de veneno, lo que hace a una relación μg de anticuerpo / μg veneno de 35:1. Se concluye que baltergin fue capaz de generar anticuerpos efectivos contra todas las hemorraginas presentes en el veneno, estableciendo reacción cruzada con epítopes presentes en dominios de estas proteínas, y por ende, anulando completamente la actividad hemorrágica del mismo. Estos resultados sientan base sobre la posibilidad de preparar nuevas formulaciones dirigidas a la terapia antiofídica, consistentes en mezclas de anticuerpos contra toxinas específicas, principales responsables de la toxicidad del veneno.