Clonado y expresión del gen de la proteína estructural VP2, de una cepa local de Parvovirus Porcino en un Sistema Procariota

RODRIGUEZ MARIA GABRIELA; KELLER, LETICIA; JAVIER CAPUCCIO; MARIA GABRIELA ECHEVERRIA; MARIA SOLEDAD SERENA; GALLO CALDERON, MARINA

Congreso; XLII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología.; 2022

El Parvovirus porcino (PPV) es uno de los agentes infecciosos más importantes asociado a fallas reproductivas en granjas porcinas; produce infección, muerte y momificación de los embriones o fetos. Es un virus desnudo, con genoma ADN monocatenario de 5000 nucleótidos, que codifica para tres proteínas estructurales (VP1, VP2 y VP3) y dos proteínas no estructurales (NS1 y NS2). La proteína de cápside VP2 contiene el mayor dominio antigénico capaz de inducir anticuerpos neutralizantes, jugando un rol fundamental en el diagnóstico e inmunoprofilaxis.En los últimos años, se viene reportando una variación genética entre las cepas de campo y las cepas de referencia y/o vacunales. Además, las sustituciones de muy pocos residuos en la VP2 son responsables de las distintas propiedades biológicas entre cepas vacunales y salvajes altamente patógenas.En un trabajo anterior, pudimos amplificar y clonar en el pGEM-T Easy Vector, el gen completo que codifica para la VP2 de una cepa local de PVP denominada "CC7", proveniente de un feto porcino de una granja de la provincia de Santa Fe sin problemas reproductivos y que utiliza la vacuna comercial.En este trabajo, nos planteamos como objetivo producir esta proteína en un sistema de expresión procariota para su posterior utilización como antígeno en un ELISA directo de fabricación local, que pueda ser de utilidad para detectar anticuerpos porcinos contra la proteína de cápside VP2.El gen de la VP2 clonado en el pGEM-T Easy Vector fue el material de partida para poder realizar el subclonado en el vector pRSETA, el cual permite la expresión de la proteína de interés fusionada a 6 His. Se digirieron tanto el vector pRSETA como el pGEM-T-VP2 con las enzimas de restricción BamHI y XhoI. Luego, se incubaron el inserto y el vector digerido y se ligó durante toda la noche a 16ºC. Se transformaron bacterias E. coli DH5α; se obtuvo el ADN plasmídico y se chequeó la secuencia. Con el ADN proveniente de los clones con la secuencia del inserto correcta, se transformaron bacterias competentes E. coli BL21. Se realizaron pruebas en distintas condiciones de inducción (concentraciones de IPTG, temperaturas y tiempos). Los lisados se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida al 10% y la detección de la VP2 se realizó mediante la técnica de WesternBlot, utilizando un anticuerpo monoclonal comercial anti-Histidina y con un pool de sueros policlonales positivos a PPV por HAI.Se pudo demostrar la expresión de la proteína VP2 (70kDa) con condiciones óptimas de 1 mM de IPTG, a 22 °C, durante toda la noche, en medio LB.Posteriormente, se analizó la localización subcelular observándose la expresión mayoritaria en la fracción insoluble.En conclusión, se logró expresar la proteína VP2 de PVP en un sistema de expresión procariota y si bien estos resultados son preliminares, esta proteína podría ser utilizada en la detección de anticuerpos específicos a través del desarrollo de un ELISA de fabricación loc