OPTIMIZACIÓN DE UNA METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN DE MELATONINA EN TEJIDOS VEGETALES. DETERMINACION MEDIANTE UHPLC-MS/MS

ISMAEL GATICA HERNANDEZ; FEDERICO J. V. GOMEZ; LUIS DANTE MARTINEZ; SOLEDAD E. CERUTTI; MARIA FERNANDA SILVA

Córdoba

Congreso; Primer Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2012

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

Melatonina (MT) es una indolamina aislada en 1959 de la glándula pineal bovina. Se encuentra ampliamente distribuida, pudiéndose encontrar en organismos como bacterias, protozoos y hongos, como así también en animales y plantas superiores. Desde su descubrimiento, se han desarrollado y mejorado diversos métodos para su determinación y evaluación de la variación circadiana en fluidos y tejidos biológicos. La presencia de MT en plantas fue informada por primera vez en 1995. Sin embargo, su estudio ha avanzado lentamente debido a problemas relativos a su extracción y cuantificación [1]. Uno de los principales inconvenientes resultó el hecho de tratar de aplicar directamente los métodos de análisis provenientes de la investigación de esta hormona en vertebrados; lo cual generó, en ciertos casos, resultados erróneos dado el efecto de las interferencias provenientes de la complejidad química de las matrices involucradas. En la actualidad, los sistemas de separación/detección considerados más confiables para el estudio de MT, e indolaminas en general, son los basados en cromatografía gaseosa (GC) ó líquida (LC) combinados con espectrometría de masas (MS) [2]. Si bien la determinación mediante LC-MS es recomendada, aún no se han desarrollado metodologías lo suficientemente universales para la extracción de MT en plantas superiores. La susceptibilidad de esta molécula a la degradación y su naturaleza química pueden ser algunas de las causas que han contribuido a la variabilidad de los resultados informados en la literatura científica [3]. Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, el presente trabajo se basó en el desarrollo de un procedimiento de extracción de MT en material vegetal de Arabidopsis thaliana. La optimización de las variables (identidad y volumen de solvente empleado, tiempo de agitación, tiempo de extracción asistida por ultrasonido y de centrifugado) se realizó mediante la aplicación de una estrategia quimiométrica multivariada de diseño factorial completo. Las muestras de hojas fueron liofilizadas y luego homogeneizadas con nitrógeno líquido previo a la extracción. Se empleó un sistema UHPLC-(+)ESI-MS/MS (Waters) para la separación, ionización, fragmentación y detección de MT. Se seleccionaron dos transiciones provenientes de la fragmentación del ión pseudomolecular de MT ([M+H]+ (m/z) = 233) para su identificación y cuantificación: 233 > 216 y 233 > 174, las cuales corresponden a pérdidas de NH3 y del grupo CH3CONH2 de la porción alifática de la molécula. Los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) fueron de 10 ng/L y 100 ng/L, respectivamente. La combinación del sistema extractivo/determinativo permitió la cuantificación de MT en hojas de Arabidopsis thaliana en concentraciones en el orden de los nanogramos por gramo de materia seca.