Diseño de un screening genético para la identificación de mutantes pdc2 de S. cerevisiae con capacidad reducida para producir etanol durante la fermentación.

CIKLIC I.; MERCADO L.; COMBINA M.

Mendoza

Jornada; III Jornadas Nacionales de Biología y Biotecnología de Levaduras.; 2011

INTA-Agencia

El calentamiento global unido a las prácticas vitivinícolas actuales de la cosecha tardía de uvas, han contribuido a la tendencia actual de obtenerse vinos con elevada concentración de etanol, lo cual genera complicaciones con el mercado de exportación si consideramos la creciente demanda de vinos más ligeros. En contraste con estrategias microbiológicas anteriores, el presente trabajo apunta a la obtención de una cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae con una leve reducción en la capacidad de producir etanol pero con un moderado impacto sobre el metabolismo. Con ese fín, se diseño un screening para identificar mutantes pdc2 con capacidad reducida para producir etanol durante la fermentación. Mediante el uso de mutagénesis aleatoria del gen regulador PDC2, se construirá una biblioteca de mutantes de donde se espera aislar una variante del factor de transcripción Pdc2p cuya actividad regulatoria positiva de los genes estructurales PDC1 y PDC5 se encuentre disminuida. Esto llevaría a una reducción en los niveles de expresión de ambos genes que codifican para dos isoformas de la enzima piruvato decarboxilasa (PDC). Consecuentemente, niveles mas bajos de expresión provocarían una merma de la actividad enzimática de PDC lo que desencadenaría un redireccionamiento del flujo de carbono desde la vía principal del etanol hacia la vía secundaria del glicerol. Actualmente, se ha clonado la copia salvaje de PDC2 en el plásmido centromérico de levaduras YCplac111. Luego, este clon positivo (denominado pIFC01) fue transformado en la cepa recipiente Δpdc2 confirmándose la correcta complementación de la deleción con la copia salvaje de PDC2 en el plásmido y bajo control de su propio promotor (se clono la secuencia completa de PDC2 mas 136 bp aguas arribas donde debería incluirse el promotor). Por otro lado, se ha puesto a punto la técnica de mutagénesis aleatoria error prone Rolling circle amplification (RCA) y se determinó cual es la dilución correcta para amplificar la mayor cantidad de ADN (1/100 de minipreps del plásmido IFC01). Finalmente, se ha comenzado con la construcción de la librería de mutantes para lo cual se requiere un gran número de transformantes. Por esa razón, se está optimizando el método de transformación para levaduras del acetato Litio con el objetivo de aumentar al máximo la eficiencia del método. Una vez completada la librería de mutantes pdc2 se prevé una selección en tres etapas mediante curvas de crecimiento, ensayos de actividad enzimática  PDC y fermentaciones con mosto sintético a escala de laboratorio.