Producción heteróloga de lacasa en Pichia pastoris. Potencial aplicación en procesos eco-amigables.

FONSECA MI

POSADAS

Jornada; IX Jornadas Cientifico - Tecnologicas FCEQyN-UNaM; 2015

Misiones posee un desarrollo industrial basado en la actividad forestal, siendouna necesidad la implementación de tecnologías limpias. En este sentido, los hongos depudrición blanca secretan enzimas oxidativas, como Lacasa (Lac), con potencial paraactuar en procesos eco-amigables como el biopulpado.El objetivo general del estudio fue profundizar el conocimiento de lascaracterísticas bioquímicas y genéticas de los sistemas ligninolíticos, específicamente delacasas, presentes en la especie fúngica cuya aplicación se pretende, así como laevaluación de las variables que influyen en la actividad enzimática para analizar suaplicación en biopulpado.Como primer paso se examinó el potencial oxidativo de hongos filamentososmediante ensayos cualitativos y se seleccionaron 5 cepas que mostraron mayor actividadligninolítica. En los ensayos cuantitativos se evaluó el efecto de la temperatura y del pHmostrando que las condiciones que mejoraron la producción de biomasa no fueron lasque soportaron la mayor actividad Lac, y el perfil isoenzimático también dependió de lascondiciones de cultivo. No fue posible detectar MnP en el medio.La principal enzima encontrada fue Lac, por lo que se continuó con su estudio.La presencia de CuSO4 aumentó los niveles de Lac y en algunos casos se asoció conmodificaciones del crecimiento. Phlebia brevispora BAFC 633, aislado de la selvamisionera e identificado molecularmente, fue seleccionado para continuar el estudio porpresentar mayor actividad Lac.Se identificó y caracterizó el gen de una Lac de P. brevispora, incluyendo 13exones y 12 intrones, que codificaría una proteína madura de 506 aminoácidos. Lasecuencia proteica deducida mostró un 61-73% de identidad con lacasas de otrosBasidiomicetes y contiene todas las regiones conservadas de unión al cobre.El cultivo en presencia de compuestos aromáticos e iones metálicos mostró unefecto positivo sobre el crecimiento con siringaldehído, siringol, guayacol, ácido sinápico,vainillina, ácido ferúlico y CuSO4. Sin embargo, disminuyó drásticamente con AgNO3 y nose modificó en presencia de CaCl2 ó MnSO4. La actividad Lac se incrementó con la adiciónde todos los compuestos ensayados, dependiendo de la concentración y del día decultivo. P. brevispora produjo dos isoenzimas monoméricas, una de 60 kDa de expresiónconstitutiva y otra de 75 kDa en presencia de ácido sinápico, MnSO4 ó CuSO4, las quefueron aisladas y caracterizadas.El mejor inductor de la actividad enzimática fue el CuSO4 y se comprobó que losniveles de ARNm se correlacionaron positivamente con la actividad enzimáticaproducida.Finalmente, se estudiaron variables que afectaron la actividad enzimática en elextracto crudo, indicando la conveniencia del biopulpado a 30°C a fin de favorecer laestabilidad enzimática. P. brevispora removió lignina selectivamente durante elbiotratamiento de chips, generando una estructura más abierta y de mejor acceso al licorde pulpado, lo que demandaría menor consumo de químicos y beneficiaría en tiempo,costos e impacto ambiental al proceso de pulpado. Estos resultados avalan el potencialbiotecnológico de la cepa seleccionada para procesos de biopulpado y realzan lasposibilidades de bioprospección de aislamientos nativos de la micoflora de ambientesnaturales de nuestro país.