Caracterización enzimática y análisis de la expresión del gen de lacasa por inducción con CuSO4 en Ganoderma applanatum cepa

SAWOSTJANIK AFANASIUK, SILVANA S.; FONSECA, MARÍA I; GIORGIO, ERNESTO M; ZAPATA, PEDRO D; VILLALBA, LAURA L

Jornada; VIII Jornadas Científico-Tecnológicas de la FCEQyN-UNaM; 2011

Ganoderma applanatum es una especie perteneciente al grupo de hongos de la pudrición blanca, especialistas en la degradación de lignina, que han cobrado interés por la potencial aplicación biotecnológica de sus enzimas ligninolíticas. La lacasa es una de las enzimas de este complejo que degrada una gran variedad de sustratos fenólicos. Recientemente se ha demostrado que el CuSO4 adicionado al medio de cultivo aumenta su actividad en el hongo que aquí se analiza. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar los parámetros enzimáticos de las lacasas producidas en extractos de cultivos por el hongo G. applanatum cepa C, nativo de Misiones y determinar el efecto del CuSO4 sobre la regulación de la expresión del gen de lacasa mediante RT-PCR. Se realizaron cultivos de micelio en medio sólido: extracto de malta 12,7 g/L, agar 20 g/L a partir de los cuales se tomaron tacos de agar con micelio y se transfirieron a medios líquidos (ME): extracto de malta 12,7 g/L, extracto soluble de maíz 0,5 % v/v; y ME suplementado de CuSO4 0,5 mM a 29°C por 7 días (día de mayor actividad enzimática). La actividad enzimática se analizó por espectrofotometría utilizando los extractos enzimáticos y como sustrato 5 mM de 2,6-dimetoxifenol, en buffer acetato de sodio 0,1 M. El cambio de la absorbancia se monitoreó a 469 nm (E469 = 27,5 mM-1 cm-1). Se evaluaron las condiciones óptimas de actividad por medición a diferentes pH y temperaturas. Luego se determinó la estabilidad enzimática por incubación de los extractos durante 7 horas en condiciones óptimas de pH y Temperatura.  El efecto del CuSO4 sobre la expresión del gen lac se analizó por RT-PCR, utilizando ARN total cuantificado por espectrofotometría a 260 y 280 nm, obtenido por extracción a partir de micelio cultivado con y sin CuSO4. Como control de técnica se amplificó un fragmento del gen de la actina. El análisis de densitometría de bandas fue realizado con el programa UN-SCAN-IT, Silk Scientific, Inc.  Se observaron mayores niveles de actividad enzimática a pH 3,6 tanto para los extractos tratados, como para el control. Sin embargo, la temperatura óptima de actividad fue de 55 °C en los extractos con CuSO4  y de 45 °C en el control. A su vez, se determinó que la vida media de la enzima presente en los extractos tratados con CuSO4  fue de 50 min. Se observó diferencia significativa en la actividad enzimática entre los extractos tratados con CuSO4 y el control (p<0,001) observándose en condiciones óptimas 1324 U/L y 11 U/L respectivamente. La adición CuSO4 produjo un aumento significativo en la expresión del gen lac evidenciado por RT-PCR. La amplificación a partir de ADNc resultó en bandas 8 veces más intensas en los tratamientos con CuSO4 respecto al control. Se concluye que el CuSO4  produce un aumento en la expresión del gen lac a nivel transcripcional, correlacionado con la mayor actividad enzimática registrada.