Clonación y Expresión en bacterias de la principal cisteín proteasa de T. cruzi: cruzipaína y sus dominios: catalítico y carboxilo terminal.

CAZORLA SI; BECKER PD; DELETTIERES D; FRANK FM; GUZMÁN CA; MALCHIODI EL

Mendoza

Congreso; VII Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2005

Sociedad Argentina de Protozoogía

La molécula de cruzipaína (Cz), principal cisteín proteasa de Trypanosoma cruzi está constituída por dos dominios: 1- catalítico, con baja antigenicidad en la infección natural y  2- carboxilo terminal que es inmunodominante y juega un rol crucial dirigiendo la respuesta inmune del hospedador contra ese fragmento.  Nos propusimos clonar y expresar la molécula entera asi como cada unos de sus dominios en un vector  de expresión procariota. Para ello se extrajo RNA a partir de epimastigotes de la cepa RA, se sintetizó el cDNA el cual fue usado como templado para amplificar, por PCR, los fragmentos de 1037, 645 y 394 pb correspondientes a la Cz entera, catalítico y carboxilo terminal respectivamente. Los fragmentos se digirieron con enzimas de restricción y se ligaron al plásmido pET23a . Se transformaron células competentes E. coli BL21 con dichos vectores y se seleccionaron los clones positivos por su resistencia a ampicilina, los que fueron posteriormente analizados para corroborar su secuencia. En todos los casos las secuencias analizadas tenían mas de un 99 % de identidad con las secuencias publicadas, y los cambios presentes no se traducían  en cambios en las secuencias de aa. Los cultivos bacterianos fueron crecidos hasta DO600nm=0.800 e inducidos con 1 mM de IPTG durante 4 horas. Las proteínas expresadas en forma de cuerpos de inclusión se purificaron por cromatografía de afinidad usando resinas de Ni- NTA  bajo condiciones desnaturalizantes. La proteína desnaturalizada fue posteriormente replegada en su conformación original.  Por inmunoblot las proteínas fueron reconocidas tanto por anticuerpos anti-cruzipaína nativa, anti-suero crónico de ratón como también por anticuerpos anti-histidina. Estas construcciones constituyen la base para futuros experimentos en los que analizaremos la capacidad protectiva de la cruzipaína recombinante y sus dominios.