Inmunoprotección frente a T. gondii empleando un microorganismo atenuado como sistema de delivery de genes antigénicos.

GONZALEZ COBIELLO PL; CERNY N; CAZORLA SI; MALCHIODI EL; MARTIN V; FRANK FM

Facultad de Farmacia y Bioquimica, UBA.

Simposio; Avances en Inmunología Básica y Aplicada. De la mesada a la clínica.; 2008

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

    Toxoplasma gondii, es un patógeno que afecta a unas 500 millones de personas, infectando al huésped por ingestión de quistes tisulares u ooquistes. Pacientes inmunosuprimidos presentan severos síntomas y en las mujeres embarazadas, la infección puede causar abortos y malformaciones fetales. En animales, toxoplasmosis causa grandes pérdidas económicas especialmente en ganado ovino y caprino. El tratamiento es difícil por sus efectos tóxicos por lo que el desarrollo de una vacuna efectiva es una alternativa atractiva. El hecho de que la inmunidad natural adquirida tras la infección sea persistente y prevenga la re-infección con T. gondii muestra la importancia del desarrollo de una vacuna que desarrolle inmunidad a nivel de mucosas. La ruta de administración de los candidatos para vacunas y el uso de adyuvantes adecuados, son factores importantes en la inducción de una respuesta inmune, por lo cual decidimos evaluar una novedosa estrategia de vacunación.        De esta manera, empleamos la vía habitual de infección como vía de inmunización, con un sistema de delivery de ADN codificante de antígenos parasitarios que promueve la respuesta Th1, como lo es el empleo de Salmonella typhimurium atenuada. Así mediante esta nueva estrategia buscamos generar inmunidad tanto sistémica como de mucosas, ambas esenciales en el control de la infección por T. gondii, empleando ADN codificante de proteínas que han mostrado poseer cierto valor inmuno-protectivo al generar respuestas sólo sistémicas.     Una importante ventaja del uso de una vacuna de ADN vehiculizado por Salmonella es que evita la exposición del ADN desnudo, ya que la bacteria se dirige específicamente hacia las células presentadoras de Ag, quienes la degradan liberando el ADN de interés y también los productos de degradación bacteriana que actuarían como un adyuvante natural. Otra ventaja importante es que la vía oral de inmunización simula la vía natural de infección.     En el presente trabajo logramos clonar los genes que codifican para la proteína ROP2 (de las roptrias) y GRA4 (de los gránulos densos) en el plásmido de expresión en células eucariotas (pcDNA3) y comprobar su expresión en células Vero transfectadas in vitro. Dichos plásmidos fueron empleados para transformar Salmonella entérica serovar typhimuium aroA 7207 la cual fue administrada en 4 dosis a ratones C3H/HeN de 6 semanas de edad por vía oral. Los grupos experimentales de ratones inmunizados fueron (GI)- S GRA4, (GII)- S ROP2, (GIII)- S GRA4 + S ROP2. Como grupos control se emplearon lotes de animales inmunizados con buffer o con Salmonella transformada con plásmido sin inserto.     En los animales inmunes se observó una significativa respuesta celular frente a los antígenos, medida por DTH. Así los animales del GI presentaron reacciones significativas frente a GRA4 (p<0.01) y ambos grupos inmunizados con S ROP2 (GII y GIII) reaccionaron positivamente frente a dicho Ag (p<0.01). Los mismos presentaron bajos títulos específicos de Ac séricos, con un predominio de IgG2a sobre IgG1, indicando un sesgo Th1.     Quince días después del último refuerzo, los ratones fueron infectados por vía oral con quistes tisulares de la cepa Me49 de T. gondii. La respuesta obtenida fue capaz de reducir los niveles séricos de las enzimas hepáticas en los ratones inmunes. A los 8 días post-infección observamos una reducción en los niveles séricos de aspartato amino-trasferasa (AST) en los grupos inmunizados con S GRA4 (GI y III) y de lactato deshidrogenasa (LDH)  en todos los animales inmunizados (GI, II y III) respecto a los grupos control (p<0.05).     Más importante aún, al analizar la carga parasitaria cerebral, a los 30 dpi, los ratones inmunizados con S-GRA4 o con S-GRA4+S-ROP2 mostraron una reducción significativa en la carga parasitaria cerebral comparada con los grupos control (p<0.05), sin mostrar diferencias significativas entre ellos. La mezcla de ambos antígenos no aumentó el nivel de protección con respecto a los antígenos individuales.     Estos resultados demuestran que el delivery del ADN de GRA4 mediado por Salmonella induce una respuesta capaz de controlar la infección por T. gondii y de esta manera reducir el daño tisular generado en la infección. Aunque la infección con T. gondii puede ser tratada en forma efectiva, el tratamiento tiene reacciones adversas especialmente en individuos inmunocomprometidos y en mujeres embarazadas ya que las drogas que se utilizan son teratogénicas. Como el tratamiento de la infección es difícil debido a los efectos tóxicos de las drogas actualmente disponibles, el desarrollo de una vacuna efectiva es una alternativa atractiva. Hasta ahora, la única vacuna comercial es la cepa S48 de taquizoitos vivos atenuados para uso en ovejas. Esta vacuna causa efectos colaterales, tiene una vida de almacenamiento corta, induce una inmunidad breve y tiene un alto costo. Más aún, al ser vacuna viva conlleva el riesgo de revertir a una cepa patogénica con lo que imposibilita su uso en humanos. La mayor parte de los trabajos actuales se están abocando a la investigación de vacunas basadas en proteínas del parásito purificadas, recombinantes, y/o de ADN. Los resultados presentados en el presente trabajo contribuyen en la generación de conocimientos bases para el diseño racional de estrategias de vacunación representando así un importante aporte a la profilaxis de una enfermedad tan ampliamente difundida como lo es la toxoplasmosis.