Detección de Salmonella sp. a partir de suero sanguíneo humano aplicando un nuevo sistema de diagnóstico multiplex por PCR en Tiempo Real

SARITA REYES; MILAGROS SAID ADAMO; EXEQUIEL FLORES; HECTOR ANTONIO CRISTÓBAL

Buenos Aires

Congreso; XXII Congreso Argentino de Infectología; 2022

La enfermedad COVID-19 fue detectada por primera vez en el año 2019 en Wuhan, China, alertando al sistema de salud mundial. El cuadro clínico caracterizado por fiebre alta, cefalea, malestar general, síntomas gastrointestinales y otros, situado en nuestro contexto epidemiológico, deja a discusión el diagnóstico diferencial con salmonelosis. Salmonella sp. es uno de los principales agentes bacterianos causantes de infecciones transmitidas por alimentos en humanos en todo el mundo. La frecuencia de casos en simultáneo ha aumentado en el último año llegando a brotes en diversas regiones del país. Implementar un sistema de detección molecular multiplex, en muestrasclínicas, es prometedor para un diagnóstico rápido, sensible y específico. La fase de aplicación exige diferentes etapas previas, entre ellas diseño (in silico), validación, estandarización y optimización (in vitro). Objetivo: Determinar el Límite de Detección (LoD) del sistema TaqMan multiplex para SARS-CoV-2 y Salmonella sp. Materiales y Métodos: El sistema fue planteado para detectar y cuantificar el gen N de SARS-CoV-2 (Eurofins) y un gen de virulencia de Salmonella sp. (MG-S), diseñado en el Laboratorio de Investigación y Diagnóstico Genético. Los plásmidos de ADN nCoV-ALL-Control y Salmonella sp. pGEM®-T Easy, fueron los controles positivos. Los vectores selinealizaron, siguiendo las especificaciones de las enzimas de restricción. Se realizaron diluciones sucesivas 1:10 del ADN lineal. La construcción de la curva de calibración incluyó 8 puntos de dilución, se realizó por duplicado. El volumen final de cada reacción fue de 10 µL, contenía 5 µL de Master Mix, solución de cebadores y sondas y 2.5 µL de muestra. Las concentraciones finales de los cebadores y sondas fueron de 150 nM y 500 nM respectivamente. Las condiciones de ciclado siguió la especificaciones de la Master Mix. Los puntos de la curva se ajustaron a una recta mediante regresión lineal. A partir de la pendiente de la curva estándar, se determinó la eficiencia de la reacción de amplificación (E). El coeficiente de correlación R 2 obtenido en la regresión lineal fue utilizado para determinar la linealidad del ensayo. Resultados: Se amplificaron los marcadores moleculares seleccionados. Se obtuvo una curva con un rango dinámico de 7 órdenes de magnitud para el sistema multiplex. El R 2 fue > 0.98 para los genes dianas. La eficiencia de amplificación fue de 94% (gen N) y 98% (MG-S). El LoD para los targets fue >1x10 2 Cg/uL. Conclusión: El sistema TaqMan multiplex presenta alta sensibilidad analítica. Proyecta una alternativa diagnóstica de biología molecular para estos patógenos de similar evolución clínica, pero muy diferente tratamiento.