Detección molecular para estudios de trazabilidad de Bacillus altitudinis utilizados como biofertilizantes en raíces de Ilex paraguariensis (yerba mate) y suelos inoculados.

CORTESE, ILIANA JULIETA; BOYCHO, MARISA ESTHER; ONETTO, ANDREA LILIANA; BICH, GUSTAVO ANGEL; ZAPATA, PEDRO DARIO; CASTRILLO, MARIA LORENA; LACZESKI, MARGARITA ESTHER

Congreso; V Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental (CAMAYA); 2021

Asociación Argentina de Microbiología

El cultivo de yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) es un importante agronegocio en Argentina, cuya producción se desarrolla en las provincias de Misiones y Corrientes. Actualmente, existen plantaciones con buen desempeño en la región, sin embargo, se ha observado un aumento de cultivos de yerba mate degradados. En este sentido, la aplicación de microorganismos con propiedades que promueven el crecimiento vegetal (PGP) es una alternativa prometedora para la producción sustentable de cultivos y la regeneración de los suelos. El grupo de trabajo aisló dos cepas identificadas como Bacillus altitudinis T5S-T4 y 19RS3 a partir de plántulas de I. paraguariensis y las seleccionó por su capacidad PGP demostrada in vitro y en vivero. Con el fin de monitorear su colonización y persistencia en el tiempo, se diseñaron marcadores moleculares específicos para cada cepa. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección molecular de las cepas de B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3 en raíces de plántulas de I. paraguariensis y suelo inoculados. Se preparó un inóculo primario de cada cepa en caldo nutritivo y se incubó a 28 °C por 24 h, se realizó una suspensión bacteriana con una concentración de 1x108 UFC/ml, luego se inocularon plántulas orgánicas de yerba mate donadas por la Fundación Alberto Roth (Santo Pipó-Misiones). Transcurridos 7 y 14 días, se realizó la extracción de ADN de raíces y suelo utilizando el kit comercial EasyPure Plant Genomic DNA Kit (ApBiotech, Argentina) y DNeasy PowerSoil Kit, MoBio (TecnoLab, Argentina), respectivamente. Para la PCR se utilizaron los cebadores cepa específicos diseñados previamente. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 20 μl, conteniendo agua libre de nucleasas, buffer 1X [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl], 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de desoxinucleósidos trifosfato (INBIO, Argentina), 10 pmol de cada uno los cebadores y 0,5 U de Taq ADN polimerasa (INBIO, Argentina). Se agregaron 5-20 ng del ADN genómico extraído. Se utilizó un ciclado compuesto por una desnaturalización inicial durante 5 min a 94ºC, seguida de 30 ciclos de 40 s a 94ºC, 70 s a 56ºC, 65 s a 72ºC, y una elongación final durante 10 min a 72ºC. Los productos de PCR se visualizaron a partir de una corrida electroforética en gel de agarosa al 2% (p/v) teñido con GelRed® (Sigma-Aldrich, Alemania). Se observaron amplicones de aproximadamente 300 y 500 pb para B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3, respectivamente, utilizando 1μl de ADN extraído de suelo tanto a los 7 y 14 días. Sin embargo, solo se observaron productos de amplificación a partir del ADN extraído de raíces a los 14 días. Estos resultados sugieren que los cebadores diseñados junto con las condiciones de amplificación optimizadas permiten la detección de las cepas de B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3 en raíces y suelo inoculados, por lo que serán aplicados en futuros ensayos de trazabilidad de los bioinoculantes en condiciones de campo.