Aislamiento de microorganismos noduladores en Prosopis strombulifera

PICCOLI P; TRAVAGLIA C; REINOSO H; COHEN A; SOSA L; LUNA V; BOTTINI R

Río Cuarto

Congreso; XXIII Reunión Nacional de Fisiología Vegetal; 2000

Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal

Aislamiento de microorganismos noduladores en Prosopis strombulifera Patricia Piccoli, Claudia Travaglia, Herminda Reinoso, Ana Cohen, Laura Sosa*, Virginia Luna, Rubén Bottini Departamento de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, Campus Universitario, 5800 Río Cuarto; ppiccoli@exa.unrc.edu.ar; *Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de San Luis, Ejército de los Andes 950, 5700 San Luis. Antecedentes En vastas regiones del centro del país existen áreas cada vez mayores de suelos susceptibles de sufrir erosión eólica y/o hídrica y con características de salinidad, que limitan la biodiversidad y la capacidad potencial de explotación de los mismos. Una de las maneras de solucionar el problema es forestar con plantas capaces de fijar y mejorar el suelo. Dentro de la subfamilia Mimosoideae, uno de los géneros utilizados es Prosopis spp. “algarrobo”, capaz de formar nódulos radicales, estructuras altamente organizadas en las que el N2 es convertido a NH3 permitiendo el crecimiento de la planta sin un suministro externo de N. En el caso particular de P. strombulifera, esta especie tiene la capacidad de sobrevivir en condiciones de salinidad de hasta 3,2 %, que es la concentración del agua de mar (Rhodes y Felker, 1978). Considerando que Prosopis strombulifera es una leguminosa y que la mayoría de éstas nodulan con algún tipo de rizobio, la hipótesis de trabajo fue que estos microorganismos cooperan en la sobrevivencia y persistencia de P. strombulifera en suelos salitrosos. Por lo tanto, en este estudio se propuso el aislamiento e identificación de microorganismos noduladores en P. strombulifera. Materiales y Métodos Aislamiento de Rhizobium spp. Se recolectaron 6 plantas vigorosas de P. strombulifera en Salinas del Bebedero (Provincia de San Luis), de las cuales dos presentaban nódulos. Los nódulos intactos de estas plantas adheridos a la raíz se cortaron con tijeras en condiciones de esterilidad, se desinfectaron en etanol 95 %, luego en hipoclorito de Na 3 % y finalmente se enjuagaron varias veces con agua destilada estéril. Los nódulos macerados en solución salina (NaCl 0.85%), se distribuyeron en diluciones decrecientes, según metodología descripta para el aislamiento de Rhizobium (Vincent, 1970). Las placas de Petri con los inóculos bacterianos se incubaron a 28ºC en posición invertida entre 2 y 5 días. Se seleccionaron las colonias probables de rizobios y se sub-cultivaron en placas de Petri con medio LMA, con el agregado de una solución de Rojo Congo durante 2 a 15 días a 28ºC para diferenciar  rizobios de crecimiento rápido y lento. Se repicaron las colonias en medio salino con el agregado de solución Tween 20 al 0.1 %. Se hicieron diluciones decrecientes en placa de Petri conteniendo Rojo Congo (Hirsch, 1998). A las placas con colonias puras se les determinó la capacidad de acidificar ó alcalinizar el medio LMA (Somasegaran y Haben, 1994). Re-infección de P. strombulifera. Para comprobar la capacidad reinfectiva y noduladora de las colonias aisladas, se utilizaron semillas de P. strombulifera escarificadas y esterilizadas superficialmente con alcohol 95 % (5 min) e hipoclorito de Na (10 min). Luego de imbibición las semillas se ubicaron en placas de Petri sobre papel de filtro e incubaron a 30°C por 24 h. Colonias aisladas se hicieron crecer en medio LMA a 30°C y 100 r.p.m. hasta DO620 = 1,0-1,2 (1.108UFC.ml-1). Los cultivos se centrifugaron, el pellet se resuspendió en PBS y se inoculó las raicillas. Se ubicó las plántulas en vasos plásticos durante 4-5 días en agua destilada estéril, con 16 h de luz a 28ºC y 8 h de oscuridad a 16 ºC respectivamente, con una intensidad lumínica de 220 mE.m-2.seg-1. El medio hidropónico fue luego reemplazado por soporte sólido (vermiculita) y regadas regularmente con solución de Jensen. Cada tres días, se incorporaba una cantidad determinada de una solución de NaCl, desde 0,1M hasta 0,4M. A los 60 días de la inoculación se determinó longitud, peso seco y fresco promedio de raíces y parte aérea. Resultados De los nódulos encontrados en plantas recolectadas de P. strombulifera de un salitral, se aislaron colonias puras y homogéneas, de crecimiento rápido, que no se tiñen con Rojo Congo. Estas colonias tuvieron la capacidad de re-infectar plantas de P. strombulifera crecidas en soporte sólido con la consiguiente formación de nódulos. El estudio anatómico reveló que estos nódulos presentan un patrón de tipo indeterminado. Tabla 1. Parámetros de crecimiento en P. strombulifera. Longitud en cm, peso en mg, datos promedio de al menos 10 individuos. Tratamiento L. raíz L. aérea PF raíz PF aérea PS raíz PS aérea P. str. +  N 10,2±1,1 10,2±1,4 75,6±12 178,6±22 58,9 ±12 125,0 ±22 P. str. - N 6,2±1,2 7,1±1,1 20,7±11 67,2±12 17,0 ±5 48,4 ±9 P. st. + R. mel. + N 9,8±1,1 8,4±1,3 61.8±14 99.0±19 40.5±11 68,3±5 P. st. + R. mel. - N 8,4±1,1 8,2±2,7 36.7±9 82.8±18 27,9±6 59,6±12 P. st. + R. sal. + N 9,8±1,6 10,8±1,8 75,0±19 159,4±22 54,2±10 103,6±18 P. st. + R. sal. - N 8,9±2,2 9,1±3,6 65,9±13 130,0±28 44,8±8 87,1±13 Discusión Los estudios en diferentes leguminosas por medio de métodos modernos de sistemática bacteriana, taxonomía numérica, hibridación de ácidos nucleicos y análisis de ARNr 16 S, han puesto de manifiesto la gran diversidad genética de la familia Rhizobiaceae (Martinez-Romero 1994, Caballero-Mellado 1998). En este trabajo se ha aislado una posible nueva especie del género Rhizobium, con una alta capacidad de tolerancia a condiciones de salinidad. Además, mediante re-inoculación y posterior crecimiento en condiciones controladas, se encontró que plantas de P. strombulifera inoculadas con el Rhizobium aislado presentan un crecimiento casi similar al control P. strombulifera + N, demostrando que esta bacteria es efectiva no sólo en producir nódulos sino que además estos son efectivos en medio con alta concentración de NaCl. Referencias Caballero-Mellado J, Martínez-Romero E. 1998. Memorias XIX Reunión Latinoamericana de Rhizobiología. Hirsch, A. 1998. Lab protocol. Workshop “Frontiers in Plant Biology”, UNRC. Martinez-Romero E, 1994. Plant Soil 161:11-20. Rhodes D, Felker P. 1987. For. Ecol. Manage. 24: 167-176 Somasegaran P, Hoben HJ. 1994. Handbook for Rhizobia: Methods in legume-Rhizobium Technology. Section 1, pp. 3-6. Vincent J. 1970. A manual for the practical study of root nodule bacteria. Blackwell  Sc. Pub. Ltd., Oxford, UK.