Purificación y caracterización de Hidrolasas de glucosil conjugados de giberelinas a partir de bacterias endofíticas

COHEN A; BOTTINI R.

Río Cuarto

Jornada; III Seminario Académico-Científico; 1998

Escuela de Posgraduación, Secretarías Académicas de Facultades y UNRC

RESUMEN: Tesis de Doctorado, Proyecto recién iniciado Titulo: “Purificación y caracterización de Hidrolasas de glucosil conjugados de giberelinas a partir de bacterias endofíticas. Rama: 200 Palabras claves: Hidrolasas, giberelinas, bacterias endofíticas Autores: Mic. Ana C. Cohen. Hipólito Yrigoyen 683. Dto 6 C1. Río Cuarto Director: Dr. Rubén Bottini Lugar de Trabajo: Fisiología Vegetal, Fac. Cs. Ex. Fís-Quím. y Nat., U.N.R.C. Beneficiarios: Investigadores en el campo de la Fisiología Vegetal Resumen: Las formas conjugadas de hormonas vegetales constituyen parte normal del metabolismo de las plantas. Las giberelinas (GAs) se conjugan exclusivamente con glucosa, uniéndose a ella tanto por el grupo carboxilo (GA-GE), o bien por un grupo hidroxilo generando una serie de isómeros de glucosil éteres (GA-G). Fisiológicamente, la característica más remarcable de los conjugados de GAs es su reversibilidad, lo que posibilita especular al menos en 4 papeles diferentes: i) transporte, ii) almacenaje, iii) regulación del exceso de formas libres biológicamente activas, iv) entrada a rutas catabólicas para su degradación (Sembdner et al. 1991). Bacterias del género Azospirillum hidrolizan conjugados de GA20 tanto in vitro (Piccoli et al. 1997) como in vivo (Cassán et al. 1998). Lo que se correlaciona complementariamente con la promoción del crecimiento de raíces de maíz inoculadas con Azospirillum spp. (Fulchieri et al. 1993) y la reversión de enanismo en mutantes enanos de arroz y maíz por Azospirillum endofítico (Lucangeli y Bottini 1997). Efectos similares se observan en plantas inoculadas con diferentes especies de bacterias endofíticas facultativas como Herbaspirillum seropedicae, Pseudomonas fluorescens, Bacillus spp., o endofíticas obligadas como Acetobacter diazotrophicus, lo que lleva a pensar en una idéntica causa. Por otra parte Chou et al. (1996) purificaron y caracterizaron hidrolasas de enterobacterias capaces de deconjugar IAA-aspartato. Estos antecedentes permiten enunciar la hipótesis que bacterias endofíticas (obligadas o facultativas) tendrían hidrolasas efectivas en la deconjugación de GAs activas sobre el crecimiento de las plantas. Por lo que el objetivo de este trabajo fue iniciar el estudio de actividad hidrolasa en cultivos de dichas bacterias sobre glucosil conjugados de GAs. METODOLOGÍA: Azospirillum lipoferum USA 5b, Azospirillum brasilense CD-JA, Acetobacter diazotrophicus PAL 5 y Pseudomonas fluorescens 49a se harán crecer en medio LB por 120 h a 30-32ºC. Cuando los cultivos alcancen una DO540 > 1,0 se centrifugará 5 min a 4ºC y 10.000 g. El pellet se resuspenderá en medio salino, se centrifugará 2 min a 4°C y 10.000 g, se sonicará 30 seg y centrifugará nuevamente 10 min a 10.000 g. Los ensayos de actividad enzimática se efectuaron incubando por 10 min y 1 h a 32°C: 1) 100 ml de sobrenadante (“extracto crudo”) + 1 mg de [14C]GA3-GE (sustrato); 2) 100 ml de medio salino + 1 mg de [14C]GA3 (control+); 3) 100 ml de medio salino + 1 mg de [14C]GA3-GE(control -); 4) 100 ml de extracto crudo (control bacteria); 5) 100 ml de medio salino (control medio). Luego de incubar se detendrá la reacción en cada caso (10 min y 1 h) con H3PO4 85%. Los distintos productos finales (tratamientos y controles) se correrán por columnas tips. Primero, en medio acuoso eluirán las formas conjugadas, y las GAs libres hidrolizadas [14C]GA3 u otro eventual metabolito) retenidas en la columna se evaluarán por recuento de radiactividad, en comparación con los tiempos de las [14C]GA3 y [14C]GA3-GE estándar de los blancos positivos y negativos.