Actividad hidrolasas de bacterias endofiticas sobre glucosil conjugados de giberelinas

PICCOLI P; COHEN A; BOTTINI R

Mar del Plata

Congreso; XXII Reunión Nacional de Fisiología Vegetal; 1998

Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal

Actividad hidrolasa de bacterias endofíticas obligadas y facultativas sobre glucosil conjugados de giberelinas Piccoli P, Cohen A, Bottini R Fisiología Vegetal, Fac. Cs. Ex. Fís-Quím. y Nat., Universidad Nacional de Río Cuarto, Campus Universitario, 5800 Río Cuarto. INTRODUCCIÓN Las formas conjugadas de hormonas vegetales constituyen parte normal del metabolismo de las plantas. Las giberelinas (GAs) se conjugan exclu-sivamente con glucosa, uniéndose a ella tanto por el grupo carboxilo (GA-GE), o bien por un grupo hidroxilo generando una serie de isómeros de glucosil éteres (GA-G). Fisiológica-mente, la característica más remar-cable de los conjugados de GAs es su reversibilidad, lo que posibilita especular al menos en 4 papeles diferentes: i) transporte, ii) alma-cenaje, iii) regulación del exceso de formas libres biológicamente ac-tivas, iv) entrada a rutas catabólicas para su degradación (Sembdner et al. 1991). Bacterias del género Azospirillum hi-drolizan conjugados de GA20 tanto in vitro (Piccoli et al. 1997) como in vivo (Cassán et al. 1998). Lo que se correlaciona complementariamente con la promoción del crecimiento de raíces de maíz inoculadas con Azospirillum spp. (Fulchieri et al. 1993) y la reversión de enanismo en mutantes enanos de arroz y maíz por Azospirillum endofítico (Lucan-geli y Bottini 1997). Efectos similares se observan en plantas inoculadas con diferentes especies de bacterias endofíticas facultativas como Her-baspirillum seropedicae, Pseudomo-nas fluores-cens, Bacillus spp., o en-dofíticas obligadas como Acetobac-ter diazotro-phicus, lo que lleva a pensar en una idéntica causa. Por otra parte Chou et al. (1996) purificaron y caracterizaron hidrola-sas de enterobacterias capaces de deconjugar IAA-aspartato. Estos antecedentes permiten enun-ciar la hipótesis que bacterias en-dofíticas (obligadas o facultativas) tendrían hidrolasas efectivas en la deconjugación de GAs activas sobre el crecimiento de las plantas. Por lo que el objetivo de este trabajo fue iniciar el estudio de actividad hidro-lasa en cultivos de dichas bacterias sobre glucosil conjugados de GAs. Materiales y métodos Azospirillum lipoferum USA 5b, Azos-pirillum brasilense CD-JA, Acetobac-ter diazotrophicus PAL 5 y Pseudo-monas fluorescens 49a se hicieron crecer en medios químicamente defi-nidos y selectivos por 72 h a 30-32ºC. Cuando los cultivos alcanza-ron una DO540 > 1,0 se centrifugaron 5 min a 4ºC y 10.000 g. El pellet se resuspendió en medio salino, se centrifugó 2 min a 4°C y 10.000 g, se sonicó 30 seg y centrifugó nue-vamente 10 min a 10.000 g. Los en-sayos de actividad enzimática se e-fectuaron incubando por 10 min y 1 h a 32°C: 1) 100 ml de sobrenadante (“extracto crudo”) + 1 mg de [2H2]GA20-GE (sustrato); 2) 100 ml de medio salino + 1 mg de [2H2]GA20 (control+); 3) 100 ml de medio salino + 1 mg de [2H2]GA20-GE (control-); 4) 100 ml de extracto crudo (control bacteria); 5) 100 ml de medio salino (control medio). El sustrato se obtuvo por síntesis orgánica parcial a partir de [2H2]GA20 y a-ceto-Br-glucosa (Schneider et al. 1989). Luego de incubar se detuvo la reacción en cada caso (10 min y 1 h) con H3PO4 y la mezcla de incubación se particionó con acetato de etilo obteniéndose dos fases: acetato conteniendo la supuesta aglicona ([2H2]GA20) y acuosa  con-teniendo [2H2]GA20-GE. Cada fase se evaporó, se retomó con metanol y se detectó la presencia de [2H2]GA20 por GC-MS previa derivatización con diazometano etéreo y BSTFA. La actividad hidrolasa se evaluó semi-cuantitativamente comparando el área de pico del ion parental de [2H2]GA20 en la fracción acetato de cada uno de los cultivos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 1. Actividad hidrolasa relativa en fase acetato. Bacteria 10 min 1 h Az lipoferum Az brasilense Ac diazotrophicus  Ps. fluorescens - - ++ - ++ + ++++ - La Tabla 1 indica que de todos los microorganismos estudiados, Azos-pirillum lipoferum, Azospirillum brasi-lense y Acetobacter diazotrophicus mostraron actividad hidrolasa sobre el sustrato. Entre ellos A. diazotro-phicus resultó la más eficiente en las condiciones experimentales utiliza-das. El método en sí se mostró ade-cuado para monitorear esta activi-dad en diferentes organismos y caracterizarla en cada caso, lo que posibilitará avanzar en la purifica-ción de la enzima. BIBLIOGRAFÍA 1.    Cassán et al. 1998. Res. XXII R. A. F. V. Mar del Plata. 2.    Chou et al. 1996. Plant Physiol. 112: 1281-1286. 3.    Fulchieri et al. 1993. Plant Cell Physiol. 34: 1305-1309. 4.    Lucangeli y Bottini 1997. Symbiosis 23: 200-207. 5.    Piccoli et al. 1997. Plant Growth Regul. 23:179-182. 6.    Schneider et al. 1989. Tethrae-dron 45: 1355-1364 7.    Sembdner et al. 1991. En Takahashi, Phinney, MacMillan eds, Gibberellins, Springer-Verlag, New York, pp. 249-263.