Actividad Hidrolasas de Acetobacter diazotrophicus sobre giberelina A3 glucosil éster

COHEN A; PICCOLI P,; BOTTINI R

Villa de Merlo, San Luis.

Congreso; XVII Reunión Científica Anual Sociedad de Biología de Cuyo; 1999

Sociedad de Biología de Cuyo

Actividad hidrolasa de Acetobacter diazotrophicus sobre gibberelina A3 glucosil éster Cohen A, Piccoli P, Bottini R Laboratorio de Fisiología Vegetal, Departamento de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, Campus Universitario, 5800 Río Cuarto, Argentina, e-mail; acohen@exa.unrc.edu.ar Formas conjugadas de hormonas vegetales constituyen parte normal del metabolismo de las plantas. Las giberelinas (GAs) se conjugan con glucosa, uniéndose a ella tanto por el grupo carboxilo (GA-GE), o bien por un grupo hidroxilo (GA-G). Bacterias del género Azospirillum hidrolizan conjugados de GA tanto in vitro (Piccoli et al. 1997, Plant Growth Regul. 23, 179-182), como in vivo (Cassán et al. 1999, XVII Reunión Soc. Biol. Cuyo). Lo que se correlaciona con la promoción del crecimiento de raíces de maíz inoculadas con Azospirillum spp. y la reversión de enanismo en mutantes enanos de arroz y maíz por A. spp endofítico. Efectos similares se observan en plantas inoculadas con diferentes especies de bacterias endofíticas, lo que lleva a pensar en una idéntica causa. Por otra parte se ha purificado y caracterizado hidrolasas de enterobacterias capaces de deconjugar IAA-aspartato. Estos antecedentes permiten enunciar que bacterias endofíticas tendrían hidrolasas efectivas en la deconjugación de GAs activas sobre el crecimiento de las plantas. Por lo que el objetivo de este trabajo fue iniciar el estudio de actividad hidrolasa en cultivos de Acetobacter diazotrophicus sobre glucosil conjugados de GAs. A. diazotrophicus PAL 5 se hizo crecer en medio LGIP por 72 h a 30-32ºC. Cuando el cultivo alcanzó una DO540 > 1,0 se centrifugó 5 min a 4ºC y 10.000 g. El pellet se resuspendió en medio salino, se centrifugó 2 min a 4°C y 10.000 g, se sonicó 30 seg y centrifugó nuevamente 10 min a 10.000 g. Los ensayos de actividad enzimática se efectuaron incubando por 10 min y 1 h a 32°C: 1) 100 ml de sobrenadante (“extracto crudo”) + 1 mg de [14C]GA3-GE (substrato); 2) 100 ml de medio salino + 1 mg de [14C]GA3 (control+); 3) 100 ml de medio salino + 1 mg de [14C]GA3-GE (control-). El substrato se obtuvo por síntesis orgánica parcial a partir de [14C]GA3 y a-ceto-Br-glucosa. Luego de incubar se detuvo la reacción con H3PO4 y la mezcla de incubación se particionó con acetato de etilo obteniéndose dos fases: acetato conteniendo la supuesta aglicona ([14C]GA3) y acuosa  conteniendo [14C]GA3-GE. Cada fase se cuantificó en un contador de centelleo. La actividad hidrolasa se evaluó semi-cuantitativamente comparando la radioactividad de [14C]GA3 en la fracción acetato. A. diazotrophicus mostró actividad hidrolasa sobre el sustrato. El método en sí se mostró adecuado para monitorear esta actividad y caracterizarla, lo que posibilitará avanzar en la purificación de la enzima.