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En la provincia de Misiones, la yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) es un cultivo de gran importancia económica. Sin embargo, el sistema agrícola de monocultivo adoptado, sobre todo en Argentina y Paraguay, presenta inadecuadas prácticas de manejo de suelo, que aceleran su erosión, compactación, progresiva pérdida de materia orgánica y nutrientes. La aplicación de biofertilizantes a base de microorganismos con propiedades que promueven el crecimiento vegetal (PGP) se presenta como una alternativa prometedora para la producción sustentable de cultivos y la regeneración de suelos degradados. En estudios previos se seleccionaron y estudiaron dos cepas endófitas esporulantes de Bacillus altitudinis aisladas de plantines de yerba mate en la provincia de Misiones. Estas cepas presentaron propiedades capaces de estimular el crecimiento vegetal, evaluadas in vitro y en vivero en plantines de yerba mate. Para continuar con la investigación se propusieron como objetivos generales validar el efecto de las cepas de B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3 en cultivos a campo y realizar estudios de trazabilidad que permitan monitorear la colonización y persistencia de ambas cepas en plantines de yerba mate.Para ello, se ensayó el efecto de las cepas de B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3 sobre plantines de yerba mate en condiciones de vivero que luego fueron llevados a campo, como así también sobre plantaciones adultas en condiciones de suelos aptos para el cultivo y en suelos degradados. A partir de cultivos bacterianos de 24 h en medio líquido (caldo nutritivo), se realizó una suspensión en agua corriente hasta llegar a la concentración de 1x108 UFC/ml correspondiente a la escala 0,5 de McFarland. En los ensayos sobre plantaciones adultas se evaluaron tres tratamientos (B. altitudinis T5S-T4, B. altitudinis 19RS3, y B. altitudinis T5S-T4 + B. altitudinis 19RS3 en partes iguales), y un control negativo (sin inoculación). En los ensayos en vivero se incluyeron además un control positivo biológico (cepa PGPR comercial, Azospirillum brasiliense sp. 245), y un control positivo químico consistente en la aplicación de 1 gr/plantín de Minicote® (13-6-16 +1,4 MgO + 10 S) por única vez al inicio de las inoculaciones. Para los ensayos en vivero se emplearon 50 plantines con buen aspecto fitosanitario para cada tratamiento, mientras que para los ensayos a campo se emplearon 45 plantas adultas ubicando cada tratamiento en iguales condiciones de intensidad lumínica. Los plantines de vivero fueron inoculados por la técnica de riego directo y las plantaciones a campo fueron inoculadas por aspersión utilizando la dilución bacteriana. El procedimiento de inoculación fue repetido en 3 ocasiones con 2 semanas de diferencia. A los plantines de vivero se les realizaron mediciones de parámetros asociados al crecimiento vegetal: altura, número de hojas, número de ramificaciones, diámetro de cuello, contenido de clorofila, área foliar y pesos secos; mientras que en las plantas adultas se midieron: cantidad de hojas y ramas cosechadas, contenido de clorofila (Clorofilio, Cavadevices) e intersección de radiación solar (Ceptómetro, Cavadevices). A partir del ensayo realizado sobre plantines de yerba mate en condiciones de vivero, se observó que los tratamientos con bioinoculantes podrían reemplazar al fertilizante químico con el cual no se observaron diferencias estadísticamente significativas para los parámetros de altura, diámetro de cuello, número de hojas, número de ramificaciones, peso seco de parte aérea, peso seco de raíz, volumen radical y clorofila medidos previamente a su pasaje a campo. Se destaca además que los tratamientos con los bioinoculantes ensayados individualmente mostraron diferencias estadísticamente significativas y positivas con respecto al fertilizante químico al evaluar la sobrevivencia de los plantines previo al pasaje a campo. Para el ensayo en plantaciones adultas en condiciones de suelos aptos para el cultivo y en suelos degradados se comenzaron a observar diferencias estadísticamente significativas para algunos parámetros medidos en forma periódica como la clorofila; sin embargo, este tipo de ensayo requiere de un seguimiento más prolongado de los cultivos, por lo que se seguirán realizando mediciones periódicas en el futuro.Por otra parte, a efectos de realizar estudios de trazabilidad de las cepas evaluadas se secuenció, ensambló (mediante los programas SPAdes, ABySS, Velvet, Soap DeNovo2, Geneious y CLC Genomics Workbench) y anotó (utilizando PROKKA, RAST y KAAS) el genoma completo de las cepas B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3. Se buscaron secuencias génicas únicas para cada cepa mediante la comparación entre ambos genomas y otros genomas de Bacillus sp. disponibles en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se seleccionaron secuencias de una longitud adecuada como blancos de amplificación, y mediante el uso de la plataforma Primer3 se diseñaron los pares de cebadores específicos para cada cepa. Estos fueron analizados empleando el programa OligoAnalyzer 3.1, y se simuló una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) in silico con los genomas de B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3 para evaluar el correcto funcionamiento de los cebadores diseñados. Finalmente, se estableció un ensayo de inoculación sobre plantines en vivero siguiendo el procedimiento aplicado en los ensayos anteriores, y se realizaron muestreos sucesivos de suelo y tejido radical a fin de evaluar la persistencia de las cepas en el tiempo. A partir de la extracción de ADN de suelo y tejido radical, se optimizó la amplificación por PCR y se obtuvieron amplicones con el tamaño correspondiente a los esperados para los cebadores diseñados. Estos resultados sugieren que los cebadores diseñados permiten la detección de las cepas de B. altitudinis T5S-T4 y 19RS3 en raíces y suelo inoculados, por lo que serán aplicados en futuros ensayos de trazabilidad del bioinoculante en condiciones de campo.

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