CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

El virus del dengue presenta cuatro serotipos (1-4) antigénicamente diferentes. El dominio III (DomIII) de la proteína E, contiene múltiples epitopes neutralizantes que son serotipo-específicos, y carece de otros que desencadenan anticuerpos no neutralizantes de reactividad cruzada. Recientemente ha sido descripta una secuencia consenso del DomIII, basándose en distintos aislamientos de cada serotipo de todo el mundo, la cual demostró capacidad de generar una respuesta inmune contra todos los serotipos. Por otra parte, se ha descripto que proteínas fusionadas a hidrofobinas, cambian su grado de hidrofobicidad y pueden ser purificadas en sistemas de dos fases acuosas basados en surfactantes no-iónicos.El objetivo de este trabajo fue expresar y purificar los diferentes DomIII de los cuatro serotipos y el consenso fusionados a hidrofobina en larvas de insecto Rachiplusia nu, para desarrollar en un futuro un nuevo kit diagnóstico.Metodología. Mediante síntesis química (GenScrip), se obtuvieron los diferentes cassettes de expresión de las secuencias del Dom III, consenso y los cuatro serotipos, fusionados a hidrofobina. Por transfección en células de insecto Sf9, se obtuvieron los diferentes baculovirus recombinantes, que expresaban GFP como gen reportero. Los baculovirus fueron amplificados para obtener stocks virales de alto título y fueron titulados por la técnica del punto final. Se infectaron larvas de insectos de la especie R. nu por inyección vía intrahemocele. Las larvas se cosecharon al presentar fluorescencia bajo luz UV. Para la purificación, a los homogenatos de larvas, se les agregó Tritón X-114 a una concentración final del 2%. Tras la separación de fases, a la fase con detergente se le agregó isobutanol para recuperar la proteína. Luego de esta segunda separación de fases, se obtuvo una segunda fase acuosa, y se formó una interfase, que fue recuperada para su análisis.Resultados. Los baculovirus recombinantes de las proteínas DomIII 1, 2, 3, 4 y consenso fusionados a hidrofobina, se obtuvieron con altos títulos, mayores a 1x108 UFP/ml. Las larvas desarrollaron fluorescencia al cuarto día post infección. Tras el método de purificación, se observó en el SDS-PAGE, una banda que correspondía al peso molecular esperado de nuestras proteínas de interés en las interfases que se formaban luego del agregado de isobutanol. Las proteínas recombinantes fueron identificadas mediante Western Blot, y posteriormente mediante espectrometría de masa.Conclusiones. Se expresaron los diferentes antígenos específicos de cada uno de los cuatro serotipos y el consenso (DomIII) mediante el sistema de baculovirus en larvas de R. nu. Tras la purificación mediante dos fases acuosas, se obtuvo en la fracción de la interfase la proteína enriquecida. La perspectiva futura para este trabajo es la puesta a punto de un kit diagnóstico para dengue que permita determinar el serotipo por el cual el paciente fue infectado, utilizando las proteínas recombinantes como antígenos

enviar mensaje