Purificación y caracterización de peroxidasa de rábano picante expresada en larvas de Spodoptera frugiperda

ALEXANDRA M. TARGOVNIK; LUCÍA V. ROMERO; FEDERICO J. WOLMAN; OSVALDO CASCONE; MARÍA V. MIRANDA

Ciudad de Buenos Aires

Congreso; Herramientas modernas para el estudio de aspectos estructurales de proteínas; 2009

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

La peroxidasa de rábano picante es útil en muchas campos de la biotecnología tales como diagnostico, biocatálisis y biosensores. Se estudiaron distintas estrategias de purificación para la enzima recombinante (rHRP) obtenida por expresión en larvas de Spodoptera frugiperda, directamente a partir del extracto total de larvas. El cADN conteniendo 2 etiquetas (6xHis y 6xARG) fue clonado bajo el promotor de poliedrina y la secuencia del péptido señal GP67. Las larvas fueron inyectadas con 50 µl de solución stock de baculovirus recombinante (1,4x107 ufp/ml) y el nivel de expresión de rHRP fue de 137 ± 17 mg HRP/Kg de larvas al día 6 dpi, equivalente a 41 µg/larva. El extracto total de larvas fue directamente sembrado en una columna SP-Sepharose y la enzima fue purificada en un solo paso con un rendimiento de 75% y un factor de purificación de 117. Por otro lado, la enzima fue también purificada por IMAC en una columna de Ni-Sepharose con un rendimiento del 86% y un factor de purificación de 29. Ambos métodos de purificación producen HRP libre de virus. El pattern de glicosilación concuerda con el esperado para invertebrados. El Km aparente fue de 12,1 ± 1,7 mM y la Vmax 2673 ± 107 U/mg, similar a la enzima obtenida por extracción de raíces de Armoracia rusticana. El proceso descripto permite obtener altos niveles de HRP activa.