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El cáncer es una enfermedad en creciente aumento a nivel mundial. En las últimas décadas la detección precoz y el desarrollo de nuevos tratamientos han permitido el control de la enfermedad y en muchos casos la cura. Sin embargo la progresión tumoral que implica la invasión y la posterior diseminación metastásica en los pacientes es una etapa que suele ser silenciosa y difícil de diagnosticar. En la última década ha aparecido el concepto de biopsia líquida como un análisis de utilidad para investigar enfermedad tumoral mínima, identificando pacientes con riesgo de recidiva tumoral. La biopsia líquida incluye un conjunto de metodologías que mediante el análisis DNA o células tumorales en sangre periférica de pacientes, permitirá identificar la reaparición de la enfermedad y/o la resistencia a un determinado tratamiento [1]. Uno de los puntos de interés en estos estudios es la identificación de una población de células tumorales denominada cáncer stem cells (CSC) que se asocian con el estado de tumores dormidos y que bajo determinadas modificaciones del microambiente pueden sufrir una transición epitelio mesenquimática migrar y generar metástasis [2], [3].El concepto de CSC debe entenderse como un proceso dinámico más que una población estática de células. Así, las CSC se destacan por tres características importantes, su estado de quiescencia, su capacidad de autorrenovación y su capacidad de pluripotencia. Estas tres características les confieren resistencia a la quimio y radio terapia y la capacidad de generar un nuevo tumor local o a distancia [4]?[7]. Aunque hay variaciones dependiendo del tipo de tumor, las CSC pueden ser identificadas por a) marcadores de membrana, como por ejemplo CD24, CD44 y CD133, que se relacionan con el origen celular y la transición epitelio mesenquimatica; b) marcadores enzimáticos intracelulares como ALDH1A1, que se relaciona con el metabolismo celular y la resistencia a drogas, y c) por la expresión de factores de transcripción, Oct3-4, Nanog y Sox2, relacionados con la capacidad de pluripotencia y de autorrenovación [8]?[13]. Debido a sus características las CSCs pueden sobrevivir y proliferar dando lugar a tumores, mientras que las no CSCs presentan una muerte celular programada (anoikis) debido a la pérdida de anclaje al sustrato [14] Por lo tanto, la formación de una esfera derivada de una sola célula in vitro, en ausencia de suero y en condiciones de baja adhesión es una técnica actualmente utilizada para aislar CSCs. La realización de ensayos de formación de esferas derivadas de una sola célula in vitro, es técnicamente más difícil que los cultivos celulares tradicionales. Para asegurar el cultivo de célula única, los investigadores han utilizado métodos con diluciones limitadas y seriadas en placas de cultivo celular de baja adhesión[15]?[17]. Sin embargo, sin un sistema robótico, este método requiere de un trabajo intensivo y limitado en el rendimiento ya que la tasa de captura está limitada por la distribución de Poisson (10-30%). La clasificación de células mediante citometría de flujo (FACS) puede automatizar el proceso de dispensación de una sola célula y lograr una mayor efectividad en la tasa de siembra; sin embargo, el elevado estrés al que son sometidas las células durante la clasificación puede afectar potencialmente a la viabilidad celular e influir en los resultados.Dado el bajo rendimiento y el alto costo que proporcionan los enfoques convencionales, y considerando además que las CSC son una población minoritaria en los tumores y que su nivel en circulación será muy baja, es de interés el desarrollo de nuevas metodologías que permitan su aislamiento, cuantificación y caracterización más efectivos y con menor costo [18]. El desarrollo de micro dispositivos es una alternativa interesante ya que ofrecen una alta relación superficie/volumen, un microambiente más homogéneo y controlable, de forma de reducir los costos y tiempo para la identificación de CSC [19], [20]. Dentro de los dispositivos de microfluídica [21], [22] los microsistemas analíticos se conciben para integrar varias operaciones de laboratorio entre las que se incluyen desde la inyección de muestras y reactivos, hasta el crecimiento y aislamiento de células. Estos microsistemas se identifican como Lab On a Chip (LOC) [23]?[27].Las características de los dispositivos LOC les hacen especialmente adecuados para la investigación de la citología del cáncer, considerando que se ha encontrado que las células tumorales presentan viabilidad mejorada, invasión y respuesta terapéutica variable cuando están incrustadas en sistemas de cultivo LOC [28], [29]. Y más interesante resulta el hecho de que los estudios basados en microfluídica abren la vía para análisis citológicos, genómicos y proteómicos integrados que permiten identificar cientos de nuevos biomarcadores potencialmente implicados en la tumorogénesis [30], [31].Ciertos dispositivos LOC son diseñados para el análisis citológico y permiten el análisis a nivel de célula única [32]. Este tipo de abordaje permite realizar el seguimiento de una célula estudiando sus características de crecimiento y comportamiento biológico. Esto es especialmente importante debido a la conocida heterogeneidad de las células que forman los tumores, que puede influir en el destino de las células, su comportamiento biológico y la respuesta terapéutica. Las CSC, no escapan a estas heterogeneidades en particular debido a su condición de estado dinámico, por ello el poder diseñar metodologías con enfoques de análisis de células únicas, permitirá evaluar esta heterogeneidad. Teniendo en cuenta las ventajas de estos dispositivos en término de la variedad de ensayos que pueden soportar combinado con el aporte de escala micro que permite utilizar bajo número de células y reactivos en general, en el presente trabajo desarrollamos un microdispositivo LOC y estudiamos su potencialidad para la cuantificación e identificación de CSC. Como modelo experimental se ha empleado células de cáncer de vejiga murinas, línea celular invasora MB49-I, que se ha demostrado contienen CSC cuando se cultivan a macro escala. El objetivo de este estudio fue, utilizando la línea celular de cáncer de vejiga MB49-I, probar la efectividad de un micro dispositivo LOC para permitir el crecimiento de CSC, analizar su heterogeneidad e investigar su interacción con diferentes componentes de la matriz extra celular. Para ello se han desarrollado tres objetivos parciales: a) diseño de un dispositivo tipo LOC y estudio de su dinámica de flujo, b) realización de cultivos en condiciones de crecimiento de CSC, análisis del crecimiento en diferentes matrices y estudio de la velocidad de crecimiento a partir de células individualizadas y c) análisis de la caracterización molecular de marcadores de CSC dentro de los dispositivos.

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