Mutaciones de sentido equivocado responsables de expresiones debiles del antigeno D

TRUCCO BOGGIONE C; PERCARA L; LUJÁN BRAJOVICH M; MATTALONI S; RUCCI A; BIONDI C; COTORRUELO C

Rosario

Congreso; XVI Congreso y XXXIV Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2014

Sociedad de Biología de Rosario

El locus RH posee dos genes estructurales dispuestos en tandem denominados RHD y RHCE que dan origen a los polipéptidos RhD y RhCE, respectivamente, que se localizan en la membrana eritrocitaria. El gen RHD posee múltiples alelos responsables de expresiones alteradas del antígeno D (variantes D) que se manifiestan a través de una intensidad reducida en las reacciones de hemaglutinación con antisueros anti-D. El objetivo de este trabajo fue caracterizar a nivel molecular tres muestras con una expresión débil del antígeno D. Se determinó el fenotipo Rh completo por técnicas de hemaglutinación utilizando anticuerpos monoclonales específicos: anti-D (clones TH-28 + MS-26), anti-C (clon MS24), anti-c (clon MS33), anti-E (clon MS260) y anti-e (clones MS16 + MS21 + MS63). Se obtuvo ADN genómico a través del método de salting-out. Se analizó por una estrategia de PCR multiplex la presencia del gen RHD. Se investigó la presencia de las variantes alélicas D débiles tipo 1, 2, 3 y 4 y de la variante parcial DVII. Posteriormente, se amplificaron por PCR alelo específica cada uno de los diez exones del gen RHD. Debido a que las muestras no resultaron portadoras de alelos detectados por las técnicas anteriores se secuenciaron los diez exones del gen RHD en cada una de ellas. El estudio de las tres muestras a nivel serológico demostró una expresión aberrante del antígeno D y que dos de ellas eran portadoras del antígeno C y una del antígeno E. Los estudios moleculares utilizando técnicas de PCR SSP no permitieron identificar alelos responsables de estos fenotipos D variantes en estudio. Los análisis de secuenciación revelaron 3 mutaciones no reportadas hasta el momento. Una de las variantes RhC+ resultó portadora de la mutación 763G>A en el exón 5 del gen RHD responsable de la sustitución de una Gly por una Arg en la posición 255. La otra muestra RhC+ presentó el cambio de base 764G>A en el mismo exón de dicho gen generando la sustitución aminoacídica Gly255Glu. Por otro lado, en la variante portadora del antígeno E se detectó la mutación puntual 911T>A en el exón 6 del gen RHD responsable del cambio de una Ile por una Asn en la posición 304. La sustitución de un aminoácido polar (Gly) por residuos cargados como el Glu ó la Arg y el cambio del residuo apolar (Ile) por otro residuo polar (Asn) provocaría alteraciones estéricas que modificarían el correcto ensamblaje del polipéptido RhD en la membrana eritrocitaria. Las modificaciones conformacionales resultantes serían responsables de la expresión débil del antígeno D observada en las muestras analizadas. El estudio molecular del locus RH resulta importante para desarrollar estrategias de tipificación de ADN confiables, que permitan realizar la genotipificación RHD prenatal y optimizar la selección de unidades a transfundir en los Bancos de Sangre.