ASOCIACIÓN GENÉTICA ENTRE VARIANTES ALÉLICAS RHD Y RHCE

TRUCCO BOGGIONE C; LUJÁN M; LERI M; RACCA A; COTORRUELO C

Casilda

Congreso; XIV Congreso y XXXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2012

Sociedad de Biología de Rosario

El locus RH está compuesto por dos genes dispuestos en tándem denominados RHD y RHCE que dan origen a los polipéptidos transmembranales RhD y RhCE respectivamente. El antígeno D es un mosaico de epitopes que se expresan en la proteína RhD. Numerosos alelos RHD son responsables de expresiones alteradas del antígeno D que se manifiestan por una intensidad reducida en la reacción de hemaglutinación con anti-D. El objetivo de este trabajo fue caracterizar a nivel molecular cinco muestras con expresión alterada del antígeno D. Se estudió este antígeno por hemaglutinación en tubo con cuatro reactivos monoclonales anti-D: IgM/IgG (clones TH28 / MS26), IgM (clon MS201), IgM (clon RUM1) e IgM (clones LDM1 y ESD1M). Posteriormente se investigó la presencia de epitopes específicos utilizando 12 anticuerpos monoclonales IgG. Se determinó el fenotipo Rh completo con anticuerpos anti-C (clone MS24), anti-c (clone MS33) y anti-e (clones MS16 + MS21 + MS63). La expresión del antígeno E se estudió con tres reactivos anti-E IgM (clones MS258/MS80, MS260 y MS80). Se obtuvo ADN genómico a través del método de salting-out. Se aplicaron técnicas de PCR SSP para detectar alelos D débiles tipo 1, 2, 3 ó 4. Mediante estrategias de PCR alelo específica se escanearon los 10 exones del gen RHD. Se secuenciaron por la técnica de Sanger cada uno de los 10 exones de ambos genes RH. La aglutinación de las cinco muestras con los diferentes reactivos anti-D IgM/IgG e IgM fue negativa excepto para el clon RUM1 que mostró una reacción débilmente positiva. Se observó aglutinación débil con los 12 anticuerpos IgG anti-D en todos los casos. El fenotipo Rh completo de las 5 muestras resultó Dvar, C-, c+, e+. Todas las muestras expresaron el antígeno E pero en 2 de ellas se obtuvieron resultados discrepantes con los diferentes reactivos utilizados mostrando intensidades de hemaglutinación muy débiles y muy intensas. Los estudios de PCR permitieron descartar los alelos D débil Tipo 1 al 4 y mostraron la presencia de los 10 exones del gen RHD. El análisis de la secuencia del gen RHD permitió identificar una nueva mutación puntual 46T>C en el exón 1 responsable del cambio Trp16Arg. Por otro lado, en las muestras con expresión alterada del antígeno E se identificaron también las mutaciones 697C>G, 712A>G, 733C>G y 744T>C en el exón 5 del alelo RHcE responsables de las sustituciones Gln233Glu, Met238Val y Leu245Val. La mutación 744 no introdujo un cambio de aminoácido. Estudios familiares permitieron determinar que ambos alelos mutados se encontraban en posición cis. El análisis de la estructura tridimensional de las proteínas RhD y RhCE utilizando el programa informático PyMOL v1.5 permitió localizar a la mutación 46T>C en la región del primer dominio transmembrana de la proteína RhD. Las mutaciones encontradas en el alelo RHcE fueron localizadas en la séptima región transmembrana de la proteína RhcE. La baja frecuencia poblacional de las variantes alélicas RHD y RHcE halladas en este estudio sugiere una asociación genética entre las mismas. La descripción de asociaciones alélicas en cis es útil para la identificación de anticuerpos dirigidos contra antígenos Rh de alta frecuencia y facilitan la compatibilidad transfusional en pacientes con genotipos poco frecuentes. El cambio de aminoácidos hidrofóbicos (Trp) o polares (Gln) por residuos cargados (Arg, Glu) dificultaría el correcto ensamblaje de los polipéptidos Rh en la membrana del eritrocito provocando la expresión alterada del antígeno D y del antígeno E. Nuestros resultados muestran que los estudios moleculares son un complemento necesario para la caracterización de muestras con fenotipo Rh variante.