INVESTIGADORES
COTORRUELO carlos miguel
congresos y reuniones científicas
Título:
EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS BANDA 3 Y GLICOFLORINA A DURANTE EL ENVEJECIMIENTO ERITROCITARIO
Autor/es:
ENSINCK A; BIONDI C; RACCA L; COTORRUELO C; RACCA A
Lugar:
Zavalla
Reunión:
Congreso; XV Congreso y XXXIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2013
Institución organizadora:
Sociedad de Biología de Rosario
Resumen:
El
envejecimiento eritrocitario está asociado a una disminución en el volumen de
los glóbulos rojos (GRs), con la producción de microvesículas, que originan
cambios en el nivel de expresión de diferentes proteínas. La principal dificultad
en el estudio del mismo es la obtención de fracciones homogéneas de GRs con la
misma edad. El objetivo de este trabajo fue evaluar el nivel de expresión de
las 2 proteínas mayoritarias de los GRs: Banda 3 (CD233) y Glicoforína A
(CD235a) por citometría de flujo (CMF) en muestras de sangre entera. Se
incubaron 50 μL de
GRs al 0.2% en PBS con anti-Banda 3 (clon 10D2, Academia de Medicina. Bs. As) que reconoce un epitope del dominio extracelular
de Banda 3, durante 30 minutos. Luego se realizó un lavado con PBS y se
agregaron 50 μL del anticuerpo secundario anti-mouse marcado con APC (BD
Pharmingen USA). Se incubaron 30 minutos en la oscuridad y posteriormente los
GRs fueron lavados una vez con PBS y resuspendidos en el diluyente FACSFlow. Para
la evaluación de la proteína Glicoforina A, se incubaron 50 μL de cada suspensión
de GRs con 50 μL de CD235a marcada
con isotiocinato de fluoresceína (FITC) (clone GA-R2(HIR2) BD Pharmingen USA).
Luego de 30 minutos se realizó un lavado con PBS y se resuspendieron en el
diluyente FACSFlow. Para ambas marcaciones se adquirieron 100.000 eventos.
Todas las muestras fueron evaluadas por duplicado. Teniendo en cuenta que FSC representa el tamaño celular y SSC la
complejidad celular interna; asumimos que la población de GRs senescentes
(GRSe) se encuentra en la zona de < FSC y > SSC. Los valores de mediana de la intensidad de fluorescencia media (IFM) de
CD233 para GRSe (31016.5 ± 4198.0) son significativamente menores que para GRJ
(34070.0 ± 5878.0) (p<0.0001) y los valores de mediana de la IFM de CD235a para GRSe son
significativamente menores (7516.0 ± 4806.5) que para GRJ (8420.5 ± 5307.0)
(p<0.001). En el análisis estadístico se aplicó el test t de student. Los resultados muestran diferencias significativas
en el nivel de la expresión de ambas proteínas evaluados entre GRSe y GRJ. La
disminución en la expresión de la proteína Banda 3 y de Glicoforina A evaluada
por CMF en la población asignada a los GRSe, puede explicarse por la pérdida de
membrana durante el envejecimiento eritrocitario mediante la formación de
microvesículas, Además, la
disminución en los niveles de expresión de Glicoforina A , presenta correlación con la pérdida de
ácido siálico que sufren los eritrocitos a lo largo de su vida, favoreciendo la
interacción de los GRSe con los
macrófagos del SMF. Estos hallazgos, junto a resultados previos con
otros marcadores de senescencia (IgG, CD47, C3), confirman que las poblaciones
de GR de distintas edades pueden analizarse por esta metodología sin realizar
una separación física de las células. La evaluación directa de los GRSe por CMF,
utiliza pequeñas cantidades de muestras y evita las manipulaciones de las
técnicas separativas.
