CUANTIFICACION ABSOLUTA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA POR PCR EN TIEMPO REAL

FORLETTI AGUSTINA; DOLCINI GUILLERMINA; LENDEZ PAMELA ANAHI; CERIANI MARIA CAROLINA; GUTIERREZ SILVINA

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Virologia; 2011

Sociedad Argentina de Virologia

El Virus de la Leucosis Bovina (BLV) es un Deltaretrovirus cuyo hospedador natural es el bovino. El BLV infecta de manera persistente al huésped integrándose en el genoma de las células en forma de provirus. Este virus se encuentra ampliamente diseminado en bovinos de producción lechera de nuestro país. Dentro de la población de animales infectados con BLV el 60% permanece asintomático, el 30% desarrolla linfocitosis persistente mientras que la forma tumoral de la enfermedad sólo se presenta en el 2 a 10% de los bovinos infectados. Dentro del grupo de animales asintomáticos pueden diferenciarse bovinos de alta carga proviral (>100000 copias de provirus/µg DNA) y de baja carga proviral (<100 copias de provirus/µg DNA) determinados por PCR semicuantitativa (1). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una metodología de cuantificación absoluta del provirus del BLV en células mononucleares de sangre periférica por PCR en tiempo real. Se decidió amplificar el gen pol, por ser un gen altamente conservado. Se realizó un MSA (Multiple Sequence Alignment) con todas las secuencias reportadas del BLV empleando el programa t-coffee. A partir de la secuencia consenso se elaboraron primers con el programa Primer Express 3.0. Los primers seleccionados se contrastaron con el MSA a fin de amplificar todas las secuencias reportadas del virus y se analizaron mediante un Primer-BLAST para determinar su especificidad in silico. Se probaron además primers reportados en la bibliografía (2). Como control positivo se utilizó la línea celular FLK que contiene 4 copias de provirus/célula. Se compararon métodos comerciales de extracción de DNA como así también diversas fuentes de DNA acompañante. Los DNAs fueron cuantificados espectrofotométricamente a 260nm. Las reacciones fueron realizadas por triplicado, utilizando el 7500 Real Time PCR System y SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Se seleccionaron los primers que amplificaron el control positivo con mayor eficiencia y dieron el mayor Ct en el DNA negativo. Se optimizó la concentración de primers y de DNA para el par de primers elegido. Se realizó la curva estándar con diluciones seriadas en base 10 de DNA de FLK, utilizando DNA proveniente de células Vero como acompañante, en un rango de 20000 a 4,88 copias del provirus por reacción de 30ng. En ese rango, la curva resultó lineal con una eficiencia de 98 a 102% (pendientes cercanas a 3.32). La concentración óptima de DNA fue de 1.5ng/µl de reacción. El límite de detección de la técnica resultó de 162,67 copias del provirus del BLV/µg de DNA. La técnica de cuantificación absoluta ha mostrado buena reproducibilidad y constituye un notable avance respecto de la cuantificación del provirus para futuros estudios del BLV.