EXPRESIÓN HETEROLOGA DE ENTEROCINA CRL35

M.L. SAAVEDRA, A. P. DE RUIZ HOLGADO, F. SESMA

Tucuman

Simposio; II Simposio Argentino –Italiano de Bacterias Lácticas; 2004

El término bacteriocina comprende un diverso grupo de péptidos o proteinas de síntesis ribosomal con actividad antimicrobiana producidos por un gran número de especies bacterianas. Sin embargo, aquellas producidas por las bacterias lácticas son las que han recibido mayor atención en los últimos  años debido a su potencial uso en la industria alimenticia como biopreservantes. La eficacia del uso de la bacteriocina o de la cepa productora en los alimentos depende de varios factores como por ejemplo, perdida espontánea del fenotipo Bac+ o cambios en las características sensoriales del producto. Por esta razón el desarrollo de sistemas de expresión eficientes de estos compuestos ofrece una alternativa atractiva. Mas aún, la expresión heteróloga de las bacteriocinas podría utilizarse para el desarrollo de cepas multibacteriocinogénicas o para conferir características antimicrobianas a cepas de interés tecnológico como aquellas usadas como cultivos starters. Enterocina CRL 35 es una bacteriocina activa frente cepas del genero Listeria producida por Enterococcus mundtii CRL35, cepa aislada de un queso artesanal de Tafí del Valle. En un trabajo previo se caracterizó molecularmente el conjunto de genes responsables de la síntesis, maduración, transporte e inmunidad de enterocina CRL35. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la expresión de enterocina CRL35 en E.coli y bacterias lácticas de interes tecnológico como primer paso para el desarrollo de sistemas de expresión eficientes que puedan ser usados en la industria alimenticia. Mediante PCR directa se amplificó el cluster completo de biosíntesis de enterocina CRL35. Este fragmento (3,128 Kb) fue clonado usando el vector pCR 2.1 TOPO Blunt (Invitrogen) y el plásmido recombinante (pMUN 4.19) transformado en E.coli DH5a. El clon recombinante (E.coli Mun35) presentó actividad antimicrobiana frente a la cepa sensible L.innocua 7, aunque con un título menor al presentado por la cepa nativa productora. Posteriormente el plásmido pMUN 4.19 fue digerido con enzimas de restricción específicas, clonado en el vector “shuttle” pMG36e, dando lugar al plásmido recombinante pMUN 5, el cual fue transformado en las siguientes bacterias lácticas: Lc lactis NZ 9000, MG1363, IL1403, Lb reuteri y Lb. sakei 23K. Solo se obtuvieron recombinantes de la cepa Lb sakei 23k, los cuales presentaron además una importante actividad anti-Listeria. Los resultados obtenidos servirán para el diseño de vectores de grado alimentario (food grade) usando el fenotipo Bac+ como marcador de selección en cepas de BAL de interés tecnológico.