Clonado Y Expresión Del Gen zwf Que Codifica Para La Glucosa 6-Fosfato Deshidrogenasa De Enterococcus mundtii CRL10

 SAAVEDRA MARÍA LUCILA; RUIZ HOLGADO AP; SESMA FERNANDO

Tucuman-Argentina

Simposio; Ier Simposio Argentino –Italiano de Bacterias Lácticas; 2002

La glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), codificada por el gen zwf, cataliza la formación de 6- fosfoglucono-d-lactona a partir de glucosa 6-fosfato, primera etapa en la vía de las pentosas fosfato. Esta vía provee ribosa para la síntesis de nucleósidos y agentes reductores (NADPH) necesarios para diferentes reacciones metabólicas. Se conoce además que esta enzima se activa fuertemente ante procesos de estrés oxidativo (por ej. presencia de H2O2). El estudio de esta vía metabólica en bacterias lácticas ha sido muy limitado, con excepción de Leuc. mesenteroides, aunque ninguno relacionado a estrés oxidativo.El objetivo de este estudio fue la identificación, clonado y expresión del gen zwf que codifica para la G6PDH en Enterococcus mundtii CRL 10. El ADN genómico de la cepa CRL10 fue digerido con diferentes enzimas de restricción (EcoRI, BamHI y  SalI) y clonado en el vector pGem 7zf(+). Los plásmidos recombinantes obtenidos fueron secuenciados y analizados on line utilizando el programa BLAST. El análisis de la secuencia del plásmido pLF14 reveló la presencia de 5 marcos de lectura abierta (ORF1-5). La secuencia deducida de aminoácidos del ORF4 y ORF5 presentaron homología con la G6PDH y con un putativo regulador dependiente de hierro, respectivamente (número de acceso GenBank AF417113). Para evaluar la expresión de la G6PDH en bacterias gram-negativas se utilizó una cepa de Escherichia coli mutante en el gen zwf, denominada Su-294. E. coli Su-294 fue transformada con pLF14 y la cepa resultante se denominó E. coli GP1. Se determinó la actividad enzimática en el extracto crudo libre de células (ECLC), midiendo espectrofotométricamente la extinción del NADPH a 340 nm. La actividad obtenida fue comparada con aquellas determinadas en el ECLC de la cepa Su-294 sin transformar y de una cepa salvaje (DH5a). Como control negativo se utilizó E. coli Su-294 transformada con el pGEM 7 z libre de inserto. Los resultados obtenidos evidenciaron la funcionalidad del gen zwf de E. mundtii en E. coli. ya que la actividad G6PDH de E. coli GP1 fue similar a la observada en la cepa salvaje. Además, no se detectó actividad enzimática en las cepas Su-294 y Su-294 transformada con pGEM 7z. Los resultados encontrados resultan interesantes ya que actualmente no existen reportes sobre la funcionalidad del gen zwf de Enterococcus en E. coli y servirán de base para conocer con mayor detalle la relación de la vía de las pentosas fosfato y los procesos oxidativos en esta bacteria láctica