Purificacion bioguiada y caracterización de un componente antibacteriano de tintura de corteza de Caesalpinia paraguariensis Burk

SGARIGLIA, M.A.; SOBERÓN, J.R.; BARRERA, M.L.; PASTORIZA, A.C.; SAMPIETRO, D.A.

Tucumán, Argentina

Congreso; IV Reunión conjunta de sociedades de biología de la República Argentina; 2020

Asociación de Biología de Tucumán

En trabajos previos determinamos la actividad antibacteriana y toxicidad de fracciones parcialmente purificadas de tintura de corteza de Caesalpinia paraguariensis (D. Parodi) Burkart (Fabaceae). La fracción con mayor bioactividad (Acetato Etilo), también exhibió toxicidad elevada. El presente trabajo se enfocó en purificar y separar el/los componente/s antibacteriano/s de los tóxicos presentes en la fracción acetato-etílica (FAE), caracterizarlo/s químicamente, determinar su Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) y citotoxicidad. FAE se fraccionó por CC-FR (C18) con gradiente Agua-Metanol (0-100%), las sub-fracciones obtenidas se analizaron por CCF de sílicagel con reveladores NP-PEG bajo luz UV365nm, cuyos perfiles de composición permitieron segregar ocho grupos diferentes (G1-G8). La actividad antibacteriana de las sub-fracciones se evaluó sobre St. aureus ATCC 25923 (inóculo 106 ufc . mL-1 ) por bioautografía directa (3 ml medio MHss inoculado, incubación a 37°C, 24 h), revelada por aspersión con una solución de MTT (2,5 mg. mL-1). La CIM/CBM se determinaron sobre St. aureus ATCC 25923 y E. faecalis ATCC 29212, por microdilución en caldo MH y posterior subcultivo en MH agarizado, de acuerdo con protocolos CLSI. La Toxicidad se evaluó determinando viabilidad de A. salina expuesta a FAE, G6 o compuestos estándar entre 1 y 1000 µg . mL-1 , por 24 h (25°C). El porcentaje de supervivencia de linfocitos humanos aislados de sangre periférica (LHSPs), cultivados en RPMI 1640, expuestos aG6 entre 1-200 µg . mL-1 , e incubados (37°C, 5% CO2, 24 h), se determinó por ensayo de actividad metabólica medible a través de MTT, en lector ELISA a 550 nm. La caracterización química de la sub-fracción más activa se realizó por análisis HPLC(DAD)-EM(ESI/Q-TOF), espectroscopía UV-Vis, CCF y revisión en base de datos y bibliografía especializada. A través del subfraccionamiento se purificó un componente (G6) con actividad bacteriostática sobre las cepas evaluadas (CIMs: 125-500 ug/ml), no tóxico (CL50 > 1000 µg . mL-1 ) y no citotóxico hasta 200 µg. mL-1ml (% Viabilidad > 75% sobre LHSPs). El análisis por CCF reveló una banda amarillo-naranja fluorescente a Rf 0,7 consistente con la presencia de un compuesto fenólico tipo flavonoide. Por HPLC-EM se detectó un pico a Tr 13,7 min compatible con la presencia de flavonoide de acuerdo a su espectro UV (DAD) λmax (MeOH) 248, 366 nm], cuya masa fue de 286 u.m.a. y C15H10O6 su fórmula molecular más probable. La búsqueda en base de datos y bibliografía arrojó al menos 6 estructuras del tipo. La información aportada por UV-Vis, así como las características de color reveladas por CCF permitieron definir la identidad del compuesto como fisetina. Este flavonol fue reportado previamente en diferentes especies de Fabaceae y otras familias, en frutos coloridos y sus jugos, pero es la primera vez que se identifica en C. paraguariensis.