Elucidación de polifenoles bioactivos de corteza de Caesalpinia paraguariensis por análisis RP-HPLC(DAD)-ESI-MS(Q-TOF)

SGARIGILA, M. A.; SOBERÓN , J.R.; PASTORIZA, A. C.; IRIARTE, M.L; SAMPIETRO D. A.

San Luis

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometria de masas; 2022

Sociedad Argentina de Espectrometria de masas (SAEM)

Estudios previos de purificación bioguiada a partir de corteza de C. paraguariensis (Burkart), permitieron generar diferentes fracciones enriquecidas en compuestos fenólicos con actividad antiinflamatoria e hipoglucemiante(1, 2). El análisis fitoquímico por técnicas cromatográficas y comparación con estándares aplicando reactivos específicos no resultaba orientativo sobre la identidad quimica, dentro de este variado grupo de metabolitos secundarios vegetales. Entonces, nos propusimos analizar y aislar los compuestos de la fracción con mayor bioactividad, por HPLC-ODS semi-preparativa con gradiente [Columna IB-SIL-C18 5 μm, 250x10 mm ID Phenomenex; fase A (1% HCOOH aq.) y fase B (1% HCOOH aq. en MeOH-ACN 6:4), gradiente: t=0min, 0% B;t=1min, 10% B;t=32 min, 90% B; t=33 min, 100% B; t=45 min, 100% B; Flujo=0,7/mL], y posteriormente analizar los compuestos aislados en un quipo Agilent 1100 Series con detector DAD acoplado a un EM híbrido QSTAR Applied Biosystem (Q-TOF) mediante la interfase ESI. Las condiciones cromatoráficas se ajustaron a escala analítica (Agilent C18 5 μm, 150x4,6 mm ID), se inyectaron 40 μL de cada compuesto (0,5 mg/mL), y se analizaron masas en rango m/z entre 50 y 2000 Da. Se obtuvieron siete (7) eluatos diferentes, M10 (tr 9,7 min), M13 (13,6), M15 (14,5), M20 (20,0), M21 (20,7), M24 (23,5), M25 (25,0). El análisis de cada compuesto en HPLC(DAD) permitió verificar la pureza (>95%), y obtener los espectros UV-Vis correspondientes. El análisis de masas se realizó en modo positivo y negativo. Los datos experimentales obtenidos: M10. UVλmax (metanol-agua) 225 nm (ε=26500), 260 nm (ε=21200); [M+H]+ (m/z) 171,028; M13. UVλmax 248 nm (ε=21500), 362 nm (ε=26200); [M+H]+ (m/z) 287,055; M15. UVλmax 273 nm (ε=11500); [M+H]+ (m/z) 459,0925, MS2 [M -169]+ (m/z) 289,071; M20. UVλmax 244,9 nm (ε=21323), 266 sh, 285 sh, 368,5 nm (ε=3376); [M+H]+ (m/z) 463,086, MS2 [M – Xilosa + 2H]+ (m/z) 331,021; M21. UVλmax 249,5 nm (ε=25650), 346 sh, 367,2 nm (ε=8400); [M - H]- (m/z) 315,994, MS2 [M – Me]- (m/z) 300,997; M24. UVλmax 246,9 nm (ε=30811), 288 sh, 361 sh, 357,7 nm (ε=9360); [M - H]- (m/z) 329,031, MS2 [M – Me]- (m/z) 315,011; M25. UVλmax 255,5 nm (ε=39790), 358 nm (ε=3182); [M - H]- (m/z) 301,148; 1H-NMR (DMSO-d6) (Bruker Avance 300 MHz): 7,51 ppm (2Heq). El análisis conjunto de la información experimental, bibliografía y base de datos (PubChem) permitieron identificar los compuestos como: Ac. Gálico (M10), Fisetina (M13), (-)-Epigalocatequin-galato (M15), 3,3’Di-O-metilelágico-β-D-xilopiranósido (M20), 3-O-metilelágico (M21), 3,3’Di-O-metilelágico (M24), Ac. Elágico (M25). El método de ionización fue conveniente para obtener los iones moleculares correspondientes, y deducir ciertos grupos funcionales. La complementariedad que aporta el detector DAD fue clave para elucidar los tipos de compuestos fenólicos presentes, ya que estos núcleos estructuralmente tan estables, que además presentan numerosos isómeros de posición, no dan lugar a muchos fragmentos que contribuyan con información para elucidarlos. Las señales obtenidas por análisis RMN sirvieron de confirmación para las estructuras propuestas por HPLC(DAD)-ESI-MS, y para identificar el azúcar del glicósido (M20), ya que por las características estructurales mencionadas, estos compuestos presentan pocas señales de interacciones, tan necesarias para proponer estructuras.