Clonado, expresión y caracterización inmunológica inicial de la Proliloligopeptidasa de 80KDa de Trypanosomacruzi (Tc80)

BIVONA A, SANCHEZ-ALBERTI A, MATOS M, MALCHIODI E, CAZORLA SI

Mar del Plata

Congreso; Reunión anual SAI-SAIC 2012; 2012

Tc80 es una proteína de secreción de T.cruzi expresada principalmente en los estadios de amastigote y tripomastigote. Pertenece a la familia S9 de serino proteasas y presenta actividad de proliloligopeptidasa.Tc80 degrada componentes de la matriz extracelular como fibronectina, colágeno tipo I y IV,por lo que se cree estaría implicada en la invasión tisular del parásito. Por esto, nos propusimos clonar Tc80, expresarla, caracterizarla inmunológicamente y evaluar su uso en el desarrollo de vacunas profilácticas y/o terapéuticas contra T.cruzi. Como primer paso, amplificamos la secuencia codificante por PCR a partir del DNA genómico de epimastigotes deT. cruzi, cepa RA. El amplicón resultante (2152pb) se digirió con enzimas de restricción que direccionaron su ligación al plásmido pET23a+. Al transformar células E.coli DH5α con dichas construcciones se seleccionaron los clones positivos por su resistencia a ampicilina y se secuenció el inserto, que mostró más de un 99% de identidad con la secuencia esperada (GenBank: AF452421.1). Su expresión en células BL21 se indujo con IPTG 0,5mM O.N. a 20ºC. La proteína expresada en forma soluble, se purificó por IMAC con Ni-NTA agarosa y mostró poseer actividad catalítica frente a un sustrato específico (Z-Gly-Pro-AMC). Por inmunización con la proteína y adyuvante de Freund se obtuvo suero de ratones anti-Tc80 que mostraron por inmunofluorescencia reconocer  epimastigotes de T.cruzi. Más importante aún, la incubación previa de tripomastigotes transgénicos Tul-beta gal con estos Ac disminuyó su invasión a células Vero. Al estudiar in vitro, la producción de NO en macrófagos J774 cultivados por 48 en presencia de Tc80 observamos un aumento respecto a los controles tratados con PBS (20.1µM y 0,42µM respectivamente) Por último, iniciamos estudios in vivo en los que inmunizamos ratones C3H los días 0 y 15, con ODNsCpG como adyuvante: GI- PBS, GII- Tc80 por vía subcutánea, GIII-Tc80 por vía intramuscular. Postinmunización observamos un elevado títulos de Ac anti-TC80 en GII y GIII (4300 y 3300 respectivamente). Al estudiar la respuesta celular desencadenada mediante  DTH observamos un aumento en el grosor de la almohadilla plantar  a las 48 hs de la inoculación de TC80  (0,015 mm, 0,2mm y 0,115mm  para GI y, GII y GIII, respectivamente). Resta evaluar si la respuesta inmune montada es protectora frente al desafío conel parásito y continuar con el estudio de las propiedades inmunomoduladoras de Tc 80