El consumo de Lactobacillus casei previene la enterocolitis causada por Salmonella enterica.

NOTO LLANA, SARNACKI, AYA CASTAÑEDA, GARAVELLO, GIACOMODONATO, CERQUETTI

Congreso; 15º Congreso Internacional de Medicina Interna del Hospital de Clínicas "José de San Martín".; 2014

Objetivo:Analizar el efecto del consumo L. casei en el desarrollo de la enterocolitis porSalmonella utilizando un modelo murino de infección.M&M:Bacteria: Se utilizó la cepa salvaje de Salmonella enterica serovariedad Enteritidis#5694 (S. Enteritidis) para infectar a los ratones. La bacteria fue cultivada en TSB(trypticase soy broth) a 37ºC, con 200 revoluciones por minuto, luego se centrifugóy fue resuspendida a la densidad apropiada en solución salina. En todos los casosel número de bacteria fue determinado por plaqueo en dilucionescorrespondientes en trypticase soy agar.Animales: En todos los experimentos se utilizaron ratones BALB/c de 6 a 8 semanasde vida.Salmonella infection and generation of enterocolitis: los animales fueronpretratados vía oral con 20 mg de estreptomicina (Sigma Aldrich). Veinticuatrohoras después los ratones se inocularon vía intragástrica (ig) con 1000 unidadesformadoras de colonias (UFC) de la cepa salvaje colocando una sonda PC-50. Adiferentes tiempos se tomaron muestras del intestino para estudios histológicos ypara estudios de PCR a tiempo real.Administración del probiótico: leche fermentada con Lactobacillus casei DN-114001 de uso comercial (Danone S.A.) fue utilizada durante este estudio. Lamisma fue administrada de manera ad libitum, como descripto anteriormente (3)durante 7 días consecutivos anteriores a la infección por S. Enteritidis. Los ratonesingirieron en promedio la dosis de 1 x 108 UFC de L. casei por día.Grupos experimentales: 1: EC: recibieron estreptomicina y Salmonella; 2: L. casei +EC: recibieron Lactobacillus casei, estreptomicina y Salmonella; 3: Control:animales sin tratar; y 4: L. casei + Strep: ratones que recibieron únicamente elprobiótico y estreptomicina.Colonización bacteriana y persistencia: A los tiempos indicados post infección, losratones fueron sacrificados y las cargas bacterianas analizadas. Todas las placasde Peyer localizadas en el intestino grueso (6 a 8) y un tercio del bazo fueronremovidas asépticamente de cada animal y homogeneizadas en solución salina estéril. Las colonias similares a Salmonella se plaquearon en agar SS y luego enagar TSI (triple-sugar-iron) y testeadas para el antígeno somático O9.Estudios histológicos: Los tejidos fueron incluidos al menos 24 horas enparaformaldehído 4%. Luego de embebidos en parafina, se hicieron cortes de 4micrones y las tinciones fueron hechas con hematoxilina y eosina (H&E).PCR a tiempo real: Los tejidos de rodilla fueron procesados de inmediato, en frío,para la extracción de ARN. Los tejidos intestinales fueron congelados a -80ºChasta el momento de la extracción. A partir del ARN se obtuvo ADNc, el cual fueusado para los experimentos realizados en un ciclador Applied Biosystem 7500. Losresultados fueron analizados con 7500 System SDS Software.Permeabilidad Intestinal in vivo: la permeabilidad intestinal fue determinadamidiendo la cantidad de FITC- dextran en sangre luego de su administracion oralcomo se describio previamente (13).Análisis estadistico: las diferencias significativas entre grupos experimentales fuerondeterminadas por analisis de varianza de una via (ANOVA) seguida dei test deTukey para múltiples comparaciones. Los valores de P de menos de 0.05 fueronconsiderados estadísticamente significativos.ResultadosAnalizamos el efecto de la consumición de L. casei sobre la respuesta inflamatoriaa la enterocolitis (EC) inducida por S. Enteritidis. Los grupos de animalesestudiados fueron: 1: EC: recibió estreptomicina y Salmonella; 2: L. casei + EC:recibió Lactobacillus casei, estreptomicina y Salmonella; 3: Control: animales sintratar; y 4: L. casei + Strep: ratones que recibieron únicamente el probiótico yestreptomicina.Cuarenta y ocho horas luego de la infeccion, los animales del grupo ECpresentaron signos de enfermedad, incluyendo diarrhea, pelos erizados y letargia.Encontramos que S. Enteritidis induce una enterocolitis difusa, caracterizada porun epitelio disminuido en altura, con infiltrado mononuclear en la mucosa ysubmucosa y perdida de la arquitectura normal de las vellosidades. Laadministración de L. casei durante una semana previa a la infección, previno loscambios histológicos (grupo L. casei + EC) asi como también la aparición de lossíntomas clínicos.El efecto protectivo de L. casei observado en el epitelio intestinal y a nivel clínicopuede estar relacionado a la disminución de la invasión bacteriana observada enel grupo L. casei + EC. Nuestros resultados claramente indican que la consumiciónde L. casei drásticamente disminuye la invasividad de S. Enteritidis y acorta supersistencia en el bazo. El epitelio intestinal preservado y la disminución en lainvasividad inducida por L. casei se correlacionaron con un 100% de sobrevida enanimales del grupo L. casei + EC. Aproximadamente 20% de los ratones con enterocolitis por Salmonella mueren hacia el día 7 post infección (8). Sin embargo,no ocurrieron muertes entre animales pertenecientes al grupo que ingirió L. casei.Ha sido demostrado que la permeabilidad intestinal decrece durante laenterocolitis (7). Para investigar el efecto de L. casei en la permeabilidad intestinaldurante la enterocolitis por Salmonella, administrados una dosis única de FITC?dextran con una jeringa a los animales a los dos días post infección y medimos laintensidad de la fluorescencia en sueron 5 horas después. El aumento de lapermeabilidad intestinal a las macromoléculas inducido por Salmonella (grupoEC) disminuyó a los niveles observados en ratones controles en animalesalimentados con L. casei previo a la enterocolitis (grupos Control y L. casei + EC).Rápido luego de la infección intestinal, S. enterica induce un aumentosignificativo en la expresión de IL-17 y citoquinas relacionadas tales como TNF-α,IL-1β, IL-6 y IL-23 (5, 8). Encontramos que los animales alimentados con elprobiótico (grupo L. casei + EC) no respondieron a la infección con el patógeno,ya que la expresión de IL-17 y de las citoquinas relacionadas a la misma fue similara la observada en ratones no infectados. Este efecto anti- inflamatorio generadopor L. casei fue más dramático en el ganglio mesentérico.ConclusiónAquí demostramos que la consumición de L. casei previo a la infección intestinalimpide la enterocolitis generada por Salmonella; el porcentaje de sobrevida, lainvasividad y persistencia de Salmonella mejoraron. A su vez, los cambioshistológicos y el aumento en la permeabilidad intestinal se evitaron.En el presente trabajo expusimos que la consumición de L. casei previene larespuesta intestinal de IL-17, entre otras citoquinas, frente a Salmonella. En untrabajo previo (8), nosotros determinamos que la neutralización de la IL-17sistémica inhibía la generación de enterocolitis. Luego de la infección porSalmonella el eje IL-23/IL-17 es gatillado en la mucosa intestinal. Los macrófagos ycélulas dendríticas infectadas con Salmonella son una fuente potencial de IL-23,una citoquina que ayuda a amplificar la respuesta inflamatoria en el tejidointestinal. Así, la IL-23 producida por los fagocitos, estimula a las células T asecretar IL-17 (5). Diferentes subtipos de células T, como Th17, γδ y NKT, presentesen la mucosa y lamina propria intestinal expresan el receptor para IL-23 y son unaimportante fuente de IL-17 durante la infección por Salmonella (5, 11).Las células Th17, γδ y NKT han sido implicadas como generadoras de IL-17 endiferentes modelos de inflamación (4). Por el otro lado, la diferenciación de lascélulas Th17 y células T γδ requiere de un ambiente específico de citoquinas elcual incluye IL-1β, IL-6 IL-23 y TGF-β (2).Aquí, mostramos que la expresión de estas citoquinas es inducida durante laenterocolitis por Salmonella y que se impide mediante la consumición de L. casei.Nuestros resultados sugieren que la consumición de L. casei altera elmicroambiente necesario para la diferenciación de las células inmunes.