Caracterización de clorogenato hidrolasa naturalmente inmovilizada en micelio no viable de Aspergillus niger AKU 3302

BUTIUK, A.P.; MAIDANA, S.A.; MARTOS, M.A.; HOURS, R.A.

Santa Fé

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral

Clorogenato hidrolasa (CHasa, EC 3.1.1.42) cataliza la hidrólisis de ácido clorogénico (ACG), liberando ácidos quínico y cafeico, productos de alto interés y valor comercial que no se producen en nuestro país. CHasa es una enzima intracelular, inducible, producida por diferentes géneros fúngicos, i.e.: Aspergillus. En estudios previos encontramos que A. niger AKU 3302 (provisto por el Prof. J. Ogawa, Univ. de Kyoto, Japón) forma pellets con elevada actividad CHasa al crecer en medio líquido. El uso de estos pellets directamente como biocatalizador (enzima naturalmente inmovilizada) está condicionado por sus propiedades catalíticas, por lo que se hace necesaria su caracterización para su posterior uso. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar parcialmente a la CHasa naturalmente inmovilizada en pellets de A. niger AKU 3302. Se cultivó la cepa de A. niger AKU 3302 en frascos agitados (180 rpm, 3 días, 30ºC), en medio Czapek líquido, utilizando un extracto acuoso de yerba mate como inductor. Los pellets fueron separados por filtración y lavados con agua destilada. Los pellets fúngicos fueron tratados térmicamente (30 min, 55°C) para inactivar el micelio pero preservando la actividad catalítica. La actividad CHasa asociada a los pellets se determinó midiendo el cambio de A350 de una solución de ACG (1,5 mM) en buffer fosfato de sodio (BFS; 50 mM, pH óptimo), durante 15 min, a 30ºC en agitador alternativo (100 golpes/min). La posible ocurrencia de limitaciones en la transferencia de masa externa fue evaluada midiendo el efecto de la velocidad de agitación (0 a 200 golpes/min) sobre la conversión del ACG. El pH y la temperatura óptimos de actividad CHasa se determinaron midiendo la actividad enzimática a diferentes pHs y temperaturas. El efecto del pH y la temperatura sobre la estabilidad de la enzima se determinaron por preincubación de la enzima en ausencia de sustrato, a diferentes valores de pH y temperaturas y posterior determinación de la actividad enzimática residual. Los parámetros cinéticos Vmáx y Km fueron determinados a partir de medidas de velocidad inicial empleando ACG como sustrato, al pH óptimo y a 30°C. Para determinar la estabilidad operacional, luego de cada ciclo de hidrólisis, los pellets fueron separados de la mezcla de reacción, lavados con buffer BFS (50 mM, pH óptimo) y reintroducidos en una nueva mezcla de reacción. La actividad enzimática residual fue determinada bajo condiciones estándar. El porcentaje de conversión de ACG se incrementó con la velocidad de agitación hasta los 20 min aproximadamente y a partir de este tiempo no se registraron incrementos a velocidades superiores a los 100 golpes/min. Se determinaron los valores de las constantes de tiempo de reacción (tr) y tiempo de difusión (td) para estimar si existen limitaciones difusionales, siendo tr>>td por lo que la reacción no es influenciada por la transferencia de masa. CHasa asociada a los pellets exhibió máxima actividad a pH 6,5 y a 50°C, con un valor de energía de activación de 11,36 kJ/mol (determinada utilizando una expresión del tipo Arrhenius). La enzima permaneció estable en el rango de pHs entre 5,0 y 8,0 luego de ser incubada en BFS durante 48 h, a 5ºC. La enzima permaneció estable hasta 50°C luego de haber sido incubada durante 8 h a pH óptimo. A partir de 55°C la enzima perdió estabilidad, reteniendo el 30% de su actividad inicial luego de 3 h de incubación e inactivándose completamente luego de 2 h a 60ºC. La hidrólisis de ACG por la CHasa inmovilizada en micelio de A. niger AKU 3302 presentó una cinética del tipo de Michaelis-Menten. Los valores de Km y Vmáx, estimados a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk, fueron de 1,38 mM y de 4,255 μmol.l-1.min-1, respectivamente. La estabilidad operacional de la CHasa inmovilizada fue determinada luego de 22 ciclos de reacción sucesivos (400 min) a 30°C. No se registró una pérdida aparente en la actividad de la enzima luego de 11 ciclos de reacción, manteniendo cerca del 80% de su actividad inicial luego de los 22 ciclos de uso reiterado. El uso de micelio fúngico no viable como biocatalizador presenta las ventajas que acarrean los sistemas con enzimas inmovilizadas y a la vez se superan los problemas asociados a la inmovilización artificial. En el presente estudio se obtuvo un biocatalizador con actividad CHasa, naturalmente inmovilizada en el propio micelio de A. niger AKU 3302. Se demostró que el mismo es estable en un amplio rango de pHs y temperaturas siendo capaz de mantener la actividad enzimática durante varios ciclos de uso repetidos. El uso potencial de este sistema de CHasa inmovilizada podría ser de considerable importancia para la producción de ácidos quínico y cafeico a partir de la hidrólisis de ACG en un biorreactor continuo de flujo pistón.