Técnicas de inmovilización enzimática para el desarrollo de bionanocatalizadores

KRAMER, G.R.; BRUERA, F.A.; SADAÑOSKI, M.A.; VELÁZQUEZ, J.E.; FONSECA, M.I.; ZAPATA, P.D.; ARES, A.E.

Posadas

Jornada; 1° Jornadas Institucionales del InBioMis; 2022

INBIOMIS-Universidad Nacional de Misiones

La inmovilización enzimática está a la vanguardia de la biocatálisis heterogénea, permitiendo la separación y reutilización de biocatalizadores en los procesos industriales. A su vez, los avances en la nanotecnología han permitido el surgimiento de nuevos diseños y conformaciones de soportes enzimáticos nanométricos con capacidad de albergar mayor cantidad de enzimas y mejorar su actividad y estabilidad como el óxido de aluminio anódico (OAA). Existe una amplia variedad de métodos de inmovilización enzimática, que pueden utilizarse y adecuarse para desarrollar bionanocatalizadores de interés industrial. Dentro de estos, la inmovilización por enlace covalente y el atrapamiento presentan la ventaja de limitar el desprendimiento de la enzima durante la reacción, mejorando la productividad y eficiencia económica del proceso. Por otro lado, las Lacasas catalizan la oxidación de una gran variedad de compuestos fenólicos con aplicaciones prometedoras en la decoloración de tintes y degradación de xenobióticos para el tratamiento de aguas residuales. La inmovilización de estas enzimas sobre películas nanoporosas de OAA, permitiría el desarrollo de un bionanocatalizador mejorado para su aplicación en el tratamiento de efluentes en continuo. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es evaluar cuatro métodos de inmovilización de Lacasas sobre OAA, a fin de desarrollar bionanocatalizadores oxidativos con elevada actividad y estabilidad enzimática. Para ello, se sintetizaron mediante oxidación anódica recubrimientos de OAA a partir de la aleación AA1050 durante 1 h a 30 V, empleando como electrolito ácido oxálico 0.3 M a 40°C y se produjo extracto enzimático crudo de Lacasa (EELac) a partir del cultivo de la cepa Phlebia brevispora BAFC 633 y posterior precipitación del sobrenadante con (NH4)2SO4 51.6 % m/v. A continuación, se inmovilizó Lacasa sobre los recubrimientos de OAA por triplicado durante 1 h utilizando una solución de EELac + buffer acetato de sodio (pH = 4.4) de concentración 1058 U/L, mediante: a) adsorción física, sumergiendo los soportes en solución de EELac + buffer con agitación; b) unión covalente, haciendo reaccionar primero el soporte con 3-amino-propiltrietoxisilano y trietanolamina en acetonitrilo seco (ACN), luego con N,N?-carbonildiimidazol en ACN y finalmente sumergiendo los soportes activados con la solución de EE + buffer; c) atrapamiento con quitosano, sumergiendo los soportes en una solución de EELac + buffer + quitosano y luego aplicando un recubrimiento protector de quitosano; c) atrapamiento con alginato de sodio, sumergiendo los soportes en una solución de EELac + buffer + alginato de sodio, con posterior inmersión en solución de CaCl2. La determinación de la actividad específica Lacasa (AELac) se realizó en un espectrofotómetro UV-visible a 469 nm con 2,6-dimetoxifenol 5 mM en buffer acetato de sodio 0.1 M (pH 3.6). Los resultados obtenidos indicaron que el método de inmovilización por unión covalente fue el más efectivo para inmovilizar Lacasas sobre los recubrimientos de OAA (AELac = 3.5 U/cm2), seguido por los métodos de inmovilización por atrapamiento con quitosano (2.5 U/cm2) y por adsorción física (2.5 U/cm2). Por otra parte, no se determinó AELac en los soportes que fueron tratados con alginato de sodio.