Insulina Induce la Traslocación de p-AKT2 y la Activación de nNOS en Mitocondrias de Músculo Esquelético: el Óxido Nítrico Dirige el Metabolismo de la Glucosa Hacia la Oxidación o Hacia la Síntesis de Glucógeno

FINOCCHIETTO PV; BARREYRO FJ; HOLOD S; PERALTA J; FRANCO MC; CONVERSO DP; CARRERAS MC; PODEROSO JJ

Ciudad de Mar del Plata

Congreso; XLXI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigaci¨®n Cl¨ªnica (SAIC). 2006; 2006

Sociedad Argentina de Investigacion Clinica

  Insulina-PI3-K activa Akt. La Oxido N¨ªtrico Sintasa neuronal (nNOS) traslocada a la mitocondria (mtNOS) presenta un dominio fosforilable por Akt en serina 1412. Objetivo: analizar efectos de insulina y Akt sobre la mtNOS y el metabolismo de la glucosa en m¨²sculo esquel¨¦tico de rata. Con este prop¨®sito ratas Wistar (200-250g) fueron inoculadas con 0.1U/Kg insulina glargina o ClNa 0.9% s.c y se extrajeron los m¨²sculos extensoris y soleus a las 3, 12 y 24 h. Las mitocondrias fueron aisladas por centrifugaci¨®n diferencial y la actividad de mtNOS se determin¨® por H3-L-Arg. La expresi¨®n y/o actividad mitocondriales de nNOS, p-Akt, y GSK- 3 ¦Á/¦Â se analizaron por Western Blot y por citometr¨ªa de flujo. La purificaci¨®n de nNOS se realiz¨® con Tag His6 en N- terminal sobreexpresada en Escherichia Coli y purificada con Kit HisLink 96 Protein Purification System. La fosforilaci¨®n de mtNOS se estudi¨® en mitocondrias incubadas con insulina, Akt-2 y 32P-ATP¦Ã. Post electroporaci¨®n e inoculaci¨®n con siRNA nNOS o Akt2 in vivo, se extrajo el m¨²sculo gastrocnemius, se midi¨® la entrada de glucosa con deoxy-D-glucose,2 [1,23H(N)], s¨ªntesis de gluc¨®geno con glucose, D-[14C(U)] y utilizaci¨®n de glucosa con glucose D-[5- 3H(N) ]. Resultados: a) AKT fosforilado trasloca a la mitocondria, b) Insulina-pAkt increment¨® 5 veces la actividad de mtNOS por fosforilaci¨®n, c) siARN nNOS disminuy¨® un tercio la incorporaci¨®n de C14-glucose a gluc¨®geno incrementando 3 veces la oxidaci¨®n a C14O2 y 3H2O, d) siRNA Akt2 redujo la actividad de mtNOS y la s¨ªntesis de gluc¨®geno un 70%. Conclusi¨®n: insulina v¨ªa Akt act¨²a sobre el metabolismo de la glucosa por su fosforilaci¨®n y traslocaci¨®n a la mitocondria. e) p-Akt fosforila mtNOS aumentando su actividad, controlando la transferencia de electrones y promoviendo las v¨ªas biosint¨¦ticas. Post electroporaci¨®n e inoculaci¨®n con siRNA nNOS o Akt2 in vivo, se extrajo el m¨²sculo gastrocnemius, se midi¨® la entrada de glucosa con deoxy-D-glucose,2 [1,23H(N)], s¨ªntesis de gluc¨®geno con glucose, D-[14C(U)] y utilizaci¨®n de glucosa con glucose D-[5- 3H(N) ]. Resultados: a) AKT fosforilado trasloca a la mitocondria, b) Insulina-pAkt increment¨® 5 veces la actividad de mtNOS por fosforilaci¨®n, c) siARN nNOS disminuy¨® un tercio la incorporaci¨®n de C14-glucose a gluc¨®geno incrementando 3 veces la oxidaci¨®n a C14O2 y 3H2O, d) siRNA Akt2 redujo la actividad de mtNOS y la s¨ªntesis de gluc¨®geno un 70%. Conclusi¨®n: insulina v¨ªa Akt act¨²a sobre el metabolismo de la glucosa por su fosforilaci¨®n y traslocaci¨®n a la mitocondria. e) p-Akt fosforila mtNOS aumentando su actividad, controlando la transferencia de electrones y promoviendo las v¨ªas biosint¨¦ticas. purificaci¨®n de nNOS se realiz¨® con Tag His6 en N- terminal sobreexpresada en Escherichia Coli y purificada con Kit HisLink 96 Protein Purification System. La fosforilaci¨®n de mtNOS se estudi¨® en mitocondrias incubadas con insulina, Akt-2 y 32P-ATP¦Ã. Post electroporaci¨®n e inoculaci¨®n con siRNA nNOS o Akt2 in vivo, se extrajo el m¨²sculo gastrocnemius, se midi¨® la entrada de glucosa con deoxy-D-glucose,2 [1,23H(N)], s¨ªntesis de gluc¨®geno con glucose, D-[14C(U)] y utilizaci¨®n de glucosa con glucose D-[5- 3H(N) ]. Resultados: a) AKT fosforilado trasloca a la mitocondria, b) Insulina-pAkt increment¨® 5 veces la actividad de mtNOS por fosforilaci¨®n, c) siARN nNOS disminuy¨® un tercio la incorporaci¨®n de C14-glucose a gluc¨®geno incrementando 3 veces la oxidaci¨®n a C14O2 y 3H2O, d) siRNA Akt2 redujo la actividad de mtNOS y la s¨ªntesis de gluc¨®geno un 70%. Conclusi¨®n: insulina v¨ªa Akt act¨²a sobre el metabolismo de la glucosa por su fosforilaci¨®n y traslocaci¨®n a la mitocondria. e) p-Akt fosforila mtNOS aumentando su actividad, controlando la transferencia de electrones y promoviendo las v¨ªas biosint¨¦ticas. Post electroporaci¨®n e inoculaci¨®n con siRNA nNOS o Akt2 in vivo, se extrajo el m¨²sculo gastrocnemius, se midi¨® la entrada de glucosa con deoxy-D-glucose,2 [1,23H(N)], s¨ªntesis de gluc¨®geno con glucose, D-[14C(U)] y utilizaci¨®n de glucosa con glucose D-[5- 3H(N) ]. Resultados: a) AKT fosforilado trasloca a la mitocondria, b) Insulina-pAkt increment¨® 5 veces la actividad de mtNOS por fosforilaci¨®n, c) siARN nNOS disminuy¨® un tercio la incorporaci¨®n de C14-glucose a gluc¨®geno incrementando 3 veces la oxidaci¨®n a C14O2 y 3H2O, d) siRNA Akt2 redujo la actividad de mtNOS y la s¨ªntesis de gluc¨®geno un 70%. Conclusi¨®n: insulina v¨ªa Akt act¨²a sobre el metabolismo de la glucosa por su fosforilaci¨®n y traslocaci¨®n a la mitocondria. e) p-Akt fosforila mtNOS aumentando su actividad, controlando la transferencia de electrones y promoviendo las v¨ªas biosint¨¦ticas.