Purificación de anticuerpos (mAbs) terapéuticos por cromatografía de afinidad utilizando ligandos peptídicos

GABRIELA R. BARREDO; SILVANA. L. GIUDICESSI; MARÍA C. MARTÍNEZ-CERÓN; FERNANDO ALBERICIO; OSVALDO CASCONE; SILVIA A. CAMPERI

Congreso; IV Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAPROBIO); 2016

1. Introducción Los biofármacos, son uno de los productos de la industria actual que más requieren de un alto grado de purificación ya que, al ser químicamente lábiles, son administrados por vía parenteral. Existen numerosos esquemas de purificación para proteínas recombinantes terapéuticas. Una de ellas, la cromatografía de afinidad (AC), se basa en un reconocimiento molecular entre la proteína de interés y un ligando inmovilizado sobre un soporte. Los péptidos cortos se han aplicado como ligandos con éxito en numerosos procesos de purificación Además, son fáciles de modificar químicamente para mejorar su estabilidad, selectividad y afinidad (Zheng y col., 2015; Camperi y col., 2014). 2. MetodologíaSe sintetizó una biblioteca combinatoria peptídica sobre bolillas de resina HMBA-ChemMatrix (HMBA-CM) por el método dividir-acoplar-recombinar (DAR). Este método consiste en (i) dividir el soporte sólido (bolillas de resina) en porciones iguales, (ii) acoplar a cada porción individual un aminoácido diferente y (iii) mezclar las porciones. El mAb terapéutico, donado por CMC Biologist, se marcó con el colorante fluorescente Texas red. Se puso en contacto una porción de la biblioteca con la proteína marcada, y las bolillas positivas (con halos rojos fluorescentes) fueron separadas a mano. Los péptidos de estas bolillas fueron separados de las mismas con vapor de amoníaco para su secuenciación por espectrometría de masa con un equipo MALDI-TOF-TOF Applied Biosystems (IIBPCB). 3. ResultadosSe obtuvieron un total de 170 bolillas positivas para una secuencia general de Ac-G-X1-X2-X3-X4-X5-X6-V-S-G-HMBA-CM. Los péptidos fueron secuenciados y se encontraron patrones de aparición de los aminoácidos presentes observándose una mayor frecuencia de Trp, Arg, Phe, Ile y Asp, los cuales, a su vez, presentaban una mayor frecuencia de aparición en posiciones determinadas dentro de dicha secuencia peptídica. En la Figura 1, se muestra un espectro MS/MS típico del un péptido positivo: 4. ConclusionesEstos resultados demuestran la gran utilidad de las bibliotecas combinatorias para la búsqueda de un ligando de afinidad para una purificación de una proteína específica. En un futuro se realizarán cromatografías usando los péptidos de las secuencias más frecuentes para, en base a ello, seleccionar el que presente mayor afinidad y selectividad para la purificación del mAb.