Control de calidad en la síntesis de inmunógenos para el desarrollo de antivenenos de arácnidos

RODRÍGUEZ JÉSICA A.; IGLESIAS-GARCÍA LUCÍA C.; BARREDO VACCHELLI, GABRIELA R.; CAMPERI, SILVIA A.

Congreso; IV Congreso argentino de espectrometría de masa; 2022

Sociedad argentina de espectrometría de masa

Los envenenamientos producidos por arácnidos constituyen una emergencia tratable con antídotosadecuados. Actualmente, se producen sueros contra los principales arácnidos de importanciamédica, sin embargo, para su producción es necesario capturar a los pequeños animales yextraerles el veneno, proceso engorroso y de bajo rendimiento. Luego, el veneno es inyectado encaballos para la producción de los anticuerpos protectores contra el envenenamiento.Teniendo en cuenta las principales toxinas responsables de los síntomas de envenenamiento porla araña Phoneutria nigriventer y el escorpión Tityus trivittatus hemos diseñado y sintetizadopéptidos inmunogénicos conformados con los epitopes de las principales toxinas para ser luegoutilizados en la producción de los sueros antivenenos. Para incrementar su inmunogenicidad seagregó ácido palmítico al extremo N terminal de los péptidos sintetizados y/o se los ramificó. Paraesto último, se utilizó la Lys que permitió acoplar los siguientes aminoácidos a partir tanto del como del  amino.Los péptidos diseñados se sintetizaron por síntesis en fase sólida utilizando la química Fmoc/tBu yla resina Rink Amide MBHA. Luego de los acoples de los aminoácidos protegidos, se eliminaron losgrupos protectores de cadenas laterales con cocktail de trifluoracético (TFA). Los péptidos serecuperaron por precipitación y se liofilizaron para su posterior análisis por RP HPLC con unacolumna columna XSelect C18 3,5μm, 4,6x50mm a 50ºC utilizando un gradiente agua/acetonitrilo(MeCN) con los solventes: A) 0,045% de TFA en agua miliQ y b) 0,036% TFA en MeCN.Posteriormente, los péptidos se analizaron por espectrometría de masas (MS) por inyección directaen un Thermo Scientific, (modelo Q-Exactive) en el CEQUIBIEM, FCEyN, UBA. La ionización de lasmuestras se realizó por electrospray (ESI) con un voltaje de 2,5 a 3,5kV.A partir de los cromatogramas se pudo demostrar una alta pureza de los péptidos lineales ypalmitoilados sintetizados, tanto los correspondientes a Tityus como a Phoneutria. Eso hizosospechar de la presencia de impurezas en el producto ramificado. En un principio, se sospechóque la incorporación del ácido palmítico podría haber sido incompleta. Sin embargo, cuando seanalizaron los ESI MS en todos los casos los picos obtenidos correspondieron a la relación m/z delion de los lipopéptidos sintetizados con la presencia de uno o más H+ y/o N+ de masamonoisotópicas 4501,64u y 4294,31u para el péptido de Phoneutria y Tityus, respectivamente. Sesospecha que la presencia de más de un pico en el cromatograma de los lipopéptidos ramificadospodría deberse a la existencia de dos conformaciones en equilibrio a una velocidad deinterconversión lo suficientemente lenta como para detectarse en el cromatograma como dosespecies distintas debido a la diferencia en la hidrofobicidad entre las conformaciones.En un futuro los lipopéptidos diseñados serán ensayados para su aplicación como inmunógenospara la generación de anticuerpos neutralizantes en el proceso de elaboración de antivenenos.