Análisis del proceso de purificación de bevacizumab con el ligando Ac-PHQGQHIGVSK-NH2 inmovilizado por mapeo peptídico

BARREDO VACCHELLI, GABRIELA R.; GIUDICESSI, SILVANA L.; CAMPERI, SILVIA A.

Congreso; IV Congreso argentino de espectrometría de masa; 2022

Sociedad argentina de espectrometría de masa

El anticuerpo monoclonal (mAb) terapéutico bevacizumab, utilizado en el tratamiento de varios tiposde cáncer, es producido por cultivo en biorreactores en células de hámster chino (CHO)recombinantes. Tradicionalmente, su purificación a partir del caldo de cultivo celular se realiza porcromatografía de afinidad con proteína A inmovilizada. El alto costo y labilidad de la proteína Asumado a las condiciones extremas para la elución del mAb, promovieron el desarrollo de un ligandoalternativo para su purificación. Recientemente, hemos diseñado soportes con PHQGQHIGVSKNH2 inmovilizado capaces de purificar bevacizumab a partir de un caldo de cultivo celular de unamanera más económica y bajo condiciones más suaves. En el presente trabajo, se llevó a cabo elproceso de purificación diseñado, a partir de muestras crudas de bevacizumab donadas por laplanta de producción mAbxience. Posteriormente, se realizó el control de calidad de la muestrapurificada por mapeo peptídico en el CEQUIBIEM, FCEyN, UBA, de manera de analizar la presenciade contaminantes provenientes del proceso de producción tanto como del producto (bevacizumab).Se realizó un SDS-PAGE bajo condiciones reductoras de la muestra proteica, y se reveló conCoomasie Coloidal. Cada banda se cortó con bisturí y se digirió con tripsina. La mezcla de péptidosde cada banda se analizó por RP-HPLC acoplado a un ESI MS (Thermo Scientific, modelo QExactive) de manera de identificar cada péptido por MS y MS/MS. Los espectros MS y MS/MSobtenidos fueron analizados con el programa Proteome Discoverer usando la base de datos deUniprot para bevacizumab y para Crisetulus griseus de manera de poder detectar impurezas tantoprovenientes del huésped (células CHO) como de productos de degradación del mAb.En el SDS-PAGE se obtuvo una banda de ≈50 kDa, otra de ≈25 kDa y una tercera banda de ≈30kDa que se encontraba en mucha menor concentración y que pudo verse gracias a la mayorsensibilidad del Coomasie coloidal. A partir del análisis por MS y MS/MS de los péptidosprovenientes de la digestión con tripsina, se identificó la cadena pesada de bevacizumab (en labanda de ≈50 kDa) y su cadena liviana (en la banda de ≈25 kDa) con un porcentaje de coberturadel 80% y 97% y un score 1521 y 1147 respectivamente. Por otro lado, se observó que la banda de≈30 kDa correspondía a un producto de degradación del mAb y no a una proteína proveniente decélulas CHO. El mayor score se encontró para la cadena pesada de bevacizumab. Cuando seanalizaron las secuencias peptídicas halladas, éstas correspondían al extremo N terminal de lacadena, abarcando los dominios VH, CH1 y parte del CH2. El porcentaje de cobertura en dicharegión es alto. Por otro lado, no se encontraron péptidos correspondientes al extremo C terminal dela cadena. Esto se puede deber a que el ligando Ac-PHQGQHIGVSK se une a la región variable delmAb, pudiéndose así adsorber a la columna aquellos fragmentos del mAb que conserven dicharegión. La presencia de productos de degradación de los mAb ha sido muy estudiada y sonoriginados principalmente por la acción de proteasas del huésped. Si bien son más abundantescuando se almacenan muestras crudas proveniente de un cultivo, también se han reportadodegradaciones debidas a proteasas residuales en los mAb purificados.El control de calidad demostró la alta selectividad del ligando por la región variable del mAb, noencontrándose contaminada la muestra por proteínas provenientes del huésped.