Purificación de fosfolipasa A2 a partir de veneno de serpiente Crotalus durissus terrificus utilizando un fosfopéptido

SOLEDAD L. SAAVEDRA; GERARDO ACOSTA; LUCIA ÁVILA; SILVANA L. GIUDICESSI; SILVIA A. CAMPERI; OSVALDO CASCONE; MARÍA C. MARTÍNEZ CERON

Congreso; EXPOFyBI 2019; 2019

Introducción:La fosfolipasa A2 (PLA2), principal componente del veneno de la serpiente Crotalus durissus terrificus (Cdt), se encuentra formando un complejo con la crotapotina (Ctp). Esta última actúa como chaperona acompañándola hasta el sitio de acción. Se ha reportado que la PLA2 es menos neurotóxica si no está acompañada por Ctp. Dicho complejo, llamado crotoxina, representa aproximadamente el 50 % del peso seco del veneno. Se ha descripto el usopotencial de la PLA2 como posible agente antiviral contra los virus del dengue y la fiebre amarilla.Actualmente, sólo existen métodos a escala de laboratorio para purificar PLA2 y no a escala industrial debido a su alto costo. Los péptidos han demostrado ser ligandos de afinidad de gran utilidad para la purificación de numerosas moléculas porque pueden ser sintetizados a bajo costo y bajo normas GMP. Además, se pueden modificar fácilmente para aumentar su estabilidad química y resistencia a las proteasas presentes en el veneno de Cdt. En trabajos anteriores se identificaron a través del uso de bibliotecas combinatorias peptídicas secuencias que en principio parecían purificar PLA2 pero que, luego, se demostró que se unían a la Ctp. Es por ello que se pensó en diseñar péptidos teniendo en cuenta los sitios de reconocimiento por su chaperona o por su sustrato enzimático (fosfolípidos). Se ha observado que Cdt presenta en su sangre inhibidores de la PLA2 para evitar ser intoxicada por la proteína endógena que pudiera llegar a su sangre. El factor neutralizantecrotálico (o CNF por sus siglas en inglés) es uno de los inhibidores presentes en la sangre de esta serpiente, que realiza su acción al uniéndose a la PLA2 y desplazando a la Ctp. La secuencia peptídica presente en CNF (P-CNF) que reconoce a PLA2 está descripta en bibliografía. Por otro lado, se ha descripto la capacidad de un péptido extraído de la secuencia de la PLA2(residuos 70-74) de inhibir dicha enzima presente en el veneno de otra serpiente del mismogénero (Crotalus durissus), por lo que fue seleccionado para evaluarlo en este trabajo (PDWI). Finalmente, se consideró el sitio de reconocimiento de PLA2 por los fosfolípidos. Con eso en mente se diseñó un fosfopéptido (P-Lys), que contenía una fosfoserina en su secuencia y a su vez se sintetizó la misma secuencia con una serina no fosforilada (P-Sol). Los péptidos así diseñados fueron sintetizados y evaluados como posibles ligandos de afinidad para purificar la PLA2 partiendo de una mezcla compleja como es el veneno de Cdt.Materiales y métodos:Los péptidos P-CNF, P-DWI, P-Lys y P-Sol se sintetizaron sobre bolillas de Rink-AmideChemMatrix utilizando Fmoc aminoácidos. El control de calidad se realizó por ESI-MS-MS y HPLC. Luego se los inmovilizó en NHS-agarose para ser utilizados como matrices cromatográficas. Se optimizaron las condiciones de siembra, lavado, elución, flujo y tiempo de contacto del proceso cromatográfico para la purificación de PLA2 presente en el veneno de Cdt. Se evaluó el desempeño de cada cromatografía a través de geles SDS-PAGE 15% y SDSPAGE-tricina. Finalmente, para identificar a las proteínas presentes en los geles se enviarona analizar las bandas por técnicas de digestión con tripsina y análisis de péptidos por espectrometría de masas ESI-QTOF (Fingerprint)Resultados:De todas las condiciones ensayadas, las mejores para purificar PLA2 a partir de veneno entero fueron a un flujo de 0,25 ml/min:- Siembra: 100 µl del veneno (150 mg/ml) en una dilución 1/20 en los buffers de adsorción encolumnas de 0,5 ml de cada matriz.- Adsorción: a) P-CNF: buffer Tris/HCl 50 mM pH 9,0. b) P-Lys: buffer Tris/HCl 10 mM pH8,0, CaCl2 10 mM, NaCl 100 mM. Para los péptidos P-DWI y P-Sol no fue posible encontrar una condición en la que se adsorbiera PLA2, sí en cambio, se adsorbió la Ctp.- Elución: a) P-CNF: buffer NaAc/HAc 100 mM pH 4,0, NaCl 250 mM y b) P-Lys: 1) buffer NaAc/HAc. 100 mM pH 4,5, NaCl 500 mM, EDTA 25 mM, 2) NaOH 50 mM.El péptido P-CNF adsorbió el 40% de la muestra. Sin embargo, al realizarse un SDS-PAGE, se observó que parte de la PLA2 salía en el lavado y que además de la PLA2 se adsorbía la Ctp. En cambio, cuando la cromatografía se realizó con P-Lys el porcentaje de adsorción alcanzó el 70%. Al realizar los geles se observó una banda en el eluido 1, de bajo PM, y 3 bandas en el eluido 2, una de las cuales corresponde al PM esperado de la PLA2. Las 4 bandas fueron enviadas para su identificación por ESI-QTOF y se pudo determinar que con el buffer de elución 1 se recuperaba crotamina (otra proteína presente en el veneno de Cdt) y con el buffer de elución 2 la PLA2 y multímeros de ésta.Conclusiones:En este trabajo se pudo diseñar un fosfopéptido que permitió recuperar la PLA2 de una muestra de veneno. A su vez, se recuperó inesperadamente crotamina, a la cual se le ha descripto un uso como posible agente antioncogénico en cáncer de piel. Por lo tanto, esta metodología permite recuperar no sólo una sino dos proteínas de interés en un solo paso cromatográfico partiendo de una muestra compleja como lo es el veneno de serpiente.