Utilización de un fosfopéptido como ligando de afinidad para la purificación de PLA2 presente en el veneno de Crotalus durissus terrificus Use of a phosphopeptide as an affinity ligand for the purification of PLA2 present in the venom of Crotalus durissus

SAAVEDRA, SOLEDAD L; ACOSTA, GERARDO; ÁVILA, LUCÍA; GIUDICESSI; SILVANA L.; CAMPERI, SILVIA A.; ALBERICIO, FERNANDO; CASCONE, OSVALDO; MARTÍNEZ CERON, MARÍA C.

CABA

Congreso; XXI Congreso Argentino de Toxicología; 2019

Se ha propuesto usar fosfolipasa A2 (PLA2) presente en el veneno de la serpienteCrotalus durissus terrificus (Cdt) como posible agente antiviral. La PLA2 se encuentra acomplejada con la crotapotina (Ctp), una chaperona que la acompaña hasta el sitio de acción. Dicho complejo, llamado crotoxina, representa aproximadamente el 50 % del peso seco del veneno. El objetivo del presente trabajo fue diseñar un método de purificación de PLA2 monomérica factible de ser escalado a nivel industrial. Los péptidos han demostrado ser ligandos de afinidad de gran utilidad para la purificación de numerosas moléculas porque pueden ser sintetizados a bajo costo. Se diseñó un fosfopéptido (P-Lys) con una fosfoserina en su secuencia y aminoácidos hidrofóbicos para mimetizar la estructura de un fosfolípido. Su síntesis se realizó en fase sólida sobreresina Rink-Amide-ChemMatrix utilizando una estrategia de síntesis Fmoc/tBu. Luego, se lo inmovilizó en NHS-agarose para ser utilizado como matriz cromatográfica de afinidad. Se optimizaron las condiciones del proceso y se evaluó su desempeño utilizando geles SDS-PAGE 15% y SDS-PAGE-tricina. También se determinó la concentración de proteínas y la actividad de la enzima en la muestra original, lavado y eluidos por el método de Bradford y del reactivo ácido 4-nitro-3-(octanoiloxi)benzoico (4N3OBA) respectivamente. Para las cromatografías se trabajó con una siembra de 100 µl del veneno fresco (150 mg/ml) en una dilución 1/20 en el buffer de adsorción. Las mejores condiciones para la purificación de PLA2 a partir de veneno, a un flujo de 0,25ml/min, fueron: buffer adsorción Tris/HCl 10 mM pH 8,0, CaCl2 10 mM, NaCl 100 mM, buffer elución 1: Aceto/Acetato de sodio 100 mM, NaCl 500 mM, EDTA 25 mM pH 4,5 y de elución 2: NaOH 50 mM. El porcentaje de adsorción alcanzó el 70% y al realizar los geles se observar on tres bandas en el eluido 2, de las cuales una corresponde al PM de la PLA2 (14 kDa). Dichas bandas fueron analizadas por espectrometría de masas y se identificaron la PLA2 y multímeros de ésta. Sólo el eluido 2 presentó actividad enzimática. El rendimiento del proceso superó el 100% (ya que la PLA2 libre posee mayor actividad que acomplejada) y el factor de purificación fue aproximadamente de 10. A través del diseño de un fosfopéptido se logró recuperar PLA2 monomérica con una pureza adecuada a partir de una muestra de veneno de Cdt en un único paso cromatográfico. Además, se ha recuperado inesperadamente en el eluido 1 y de formaseparada una segunda proteína, la crotamina, a la cual se la ha mencionado como posible agente terapéutico como anticancerígeno y analgésico.