Desarrollo de métodos alternativos de purificación de toxoide diftérico para atenuar las reacciones adversas a la vacuna antidiftérica.

MARTÍNEZ-CERON, M. C.; GIUDICESSI, S. L.; DOKMETJIAN, C.; CAMPERI, S. A.; CASCONE, O.

Congreso; 7º Congreso y Exposición para producción farmacéutica, biotecnológica y veterinaria; 2012

La difteria es una enfermedad respiratoria aguda epidérmica causada por la toxina (DT) secretada por Corynebacterium diphtheriae. DT inhibe la síntesis proteica en células de mamífero por inactivación del factor de elongación (EF2). La enfermedad es tratada aplicando suero equino hiperinmune antidifteria. La prevención de la enfermedad se logra con un programa adecuado de vacunación. El toxoide (DTx) utilizado para la preparación de vacuna diftérica se obtiene por inactivación con formaldehido de la DT producida en cultivos de C. diphtheriae. Generalmente para la preparación de vacunas se emplea el DTx parcialmente purificado por filtración y ultrafiltración. Las reacciones colaterales producidas por la vacunación están directamente relacionadas con la presencia de contaminantes en las vacunas. El aumento del grado de pureza de la DTx disminuiría las reacciones adversas producidas por la vacunación y permitiría el aumento de las dosis mejorando el sistema de inmunización. Actualmente existen protocolos de purificación para obtener DTx con alto grado de pureza pero debido a su alto costo sólo se aplican a nivel analítico y no en la preparación industrial de vacunas. En general consisten en la recuperación de DT a partir de sobrenadantes de cultivos por precipitación seguido de una serie consecutiva de pasos cromatográficos que incluyen: cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de afinidad (AC) utilizando como ligandos de afinidad NAD o Cibacron blue. Según el protocolo, DT puede ser inactivada al principio o al final del proceso de purificación para producir DTx. Dado que el proceso de purificación en varias etapas involucra la manipulación de una toxina peligrosa durante un tiempo relativamente largo, la inactivación de la DT al inicio del proceso y posterior purificación de la DTx mejora la bioseguridad del proceso[C1] . Los procesos de afinidad se basan en un reconocimiento molecular entre la proteína de interés y un ligando inmovilizado sobre un soporte. Con un ligando de afinidad con la selectividad adecuada, se puede purificar la proteína de interés presente en mezclas complejas con alta pureza y rendimiento en un solo paso. Si bien los anticuerpos monoclonales (mAbs) son ligandos de alta afinidad y especificidad, su elevado costo impide su escalado a nivel industrial. Por otro lado, los ligandos biomiméticos como los colorantes triazínicos son ideales como ligandos para separaciones industriales por afinidad ya que pueden ser sintetizados a un costo muy inferior a los mAbs y en forma aséptica bajo normas GMP. Son mucho más estables y las interacciones entre los colorantes y las proteínas son generalmente moderadas, lo que resulta en condiciones suaves de elución. Específicamente, el Cibacron blue ha sido propuesto para la purificación de DT. Para desarrollar un proceso de afinidad altamente selectivo para DTx es esencial la identificación de un ligando con suficiente selectividad y fuerza de unión. Existen disponibles gran cantidad de colorantes triazínicos comerciales que consisten en un grupo cromóforo unido a un grupo reactivo monocloro o dicloro trazina que permite su unión a matrices cromatográficas por sustitución nucleofílica sin activación previa. La adsorción de proteínas a colorantes triazínicos es muy compleja e intervienen tanto interacciones electrostáticas, hidrofóbicas, de van der Walls y puentes de hidrógeno. Esto hace imposible predecir el comportamiento de una proteína con un colorante en particular y se requiere del screening de varios de ellos para encontrar el óptimo para los objetivos deseados y de estudios experimentales exhaustivos para obtener las condiciones óptimas de operación. Para hallar el colorante más adecuado para ser usado como ligando de afinidad se realizó un screening de 20 colorantes diferentes, todos inmovilizados sobre una matriz de agarosa. De esta manera se encontraron 3 colorantes adecuados: Reactive Blue 15, Naranja R-HE y Cibacron blue.