Nanopartículas magnéticas con un ligando peptídico inmovilizado para purificar bevacizumab

GABRIELA R BARREDO-VACCHELLI; JUAN F ORLOWSKI; SILVANA L GIUDICESSI; SILVIA A CAMPERI

CABA

Workshop; FNBT 2022- Workshop Internacional; 2022

FFyB-UBA

El bevacizumab se une al factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) bloqueando su acción angiogénica, por lo que se lo aplica en el tratamiento de determinados tipos de cáncer. Es producido en células CHO y purificado por cromatografía de afinidad (AC) con proteína A inmovilizada. La AC requiere un paso previo de clarificación del caldo de cultivo celular, para evitar la obstrucción de la columna. La proteína A es un ligando altamente costoso y las condiciones extremadamente ácidas de elución dañan tanto al mAb a purificar como a la proteína A. Alternativamente, las nanopartículas magnéticas (NPM), forman suspensiones coloidales estables y tienen una alta área superficial por unidad de volumen, lo que aumenta su capacidad de adsorción. Se pueden mezclar directamente con la muestra sin previa clarificación. El complejo magnético se remueve fácilmente utilizando un separador magnético. Asimismo, los péptidos cortos son ideales como ligandos para separaciones industriales ya que pueden sintetizarse a gran escala y a bajo costo, son mucho más estables que los ligandos proteicos y permiten condiciones moderadas de elución.En el presente trabajo se desarrolló una estrategia de purificación de bevacizumab basada en un ligando peptídico unido a NPM.En base a estudios previos de la interacción entre bevacizumab y el VEGF-A, se evaluó por dinámica molecular (MD) la interacción del fragmento 85-PHQGQHIG-92 del VEGF-A con el bevacizumab fuera de la estructura proteica. Contar con las estructuras cristalográficas del complejo proteico, junto con estudios previos de MD, permitieron identificar los aminoácidos de bevacizumab involucrados en la interacción con el péptido PHQGQHIG, hallándose modelos con buena performance en el acoplamiento molecular al ser evaluados por su energía de unión. Los estudios in silico demostraron así que PHQGQHIG podría ser un ligando adecuadopara su aplicación en AC.Posteriormente, se sintetizó químicamente el péptido Ac-PHQGQHIGVSK mediante síntesis en fase sólida (SPPS) utilizando la química Fmoc/tBu y se lo analizó por RP-HPLC y MALDI MS. La Lys actuó de brazo espaciador, junto con Val-Ser, y permitió unir al péptido a NPM activadas con el éster N-hidroxisuccinimidilo (NHS) a través del ε amino. Las NPM con el péptido inmovilizado se añadieron a una muestra de bevacizumab de un cultivo de células CHO en microtubos. Las NPM se separaron utilizando una gradilla magnética y luego se eluyeron las proteínas adsorbidas. Las muestras se evaluaron mediante SDS-PAGE, lo que demostró que las NPM pueden adsorber bevacizumab de forma selectiva.NPM con el ligando peptídico inmovilizado podría aplicarse para la purificación de bevacizumab a partir de medios de cultivo sin clarificación previa. Además, podría utilizarse para facilitar la toma de muestras para el control de calidad del mAb durante su proceso de producción