Análisis del estado de metilación del promotor 1 del gen ptpn6 mediante secuenciación bisulfito.

GIORGIO EM, CHANETON BJ, DE LA ROSSA A, CUBILLA MA, TISCORNIA MM, ZAPATA PD

Posadas

Jornada; II Jornadas Nacionales De Estudiantes De Biología – 1-3 de junio 2007; 2007

JONEBI

La fosfotirosina fosfatasa SHP-1 (PTPN6) es una enzima con dominios SH2 a través de los cuales se encuentra asociada a residuos de tirosina fosforilados en sitios específicos. A través de este mecanismo esta enzima actúa modulando los efectos proliferativos de muchos factores de crecimiento, así como favoreciendo la formación de los complejos de adhesión focal y la comunicación con la matriz. Estas características alientan su clasificación como gen supresor de tumores y se encuentran ampliamente estudiadas en células hematopoyéticas. Sin embargo, PTPN6 también se expresa en tejido epitelial, habiéndose demostrado recientemente la disminución o anulación de su expresión en carcinomas avanzados de origen prostático. La expresión del gen ptpn6 esta mediada a través de 2 secuencias reguladoras. La expresión en tejido hematopoyético esta controlada mediante el Promotor 2 ubicado dentro del primer intrón, mientras que la expresión en tejido epitelial esta regulada mediante el Promotor 1 ubicado en posición 5’ upstream del exón 1. Recientes estudios sobre el promotor 2 indican que los cambios de expresión observados podrían deberse a cambios en el patrón de metilación del gen, sin embargo el estado de metilación del promotor 1 no ha sido aun estudiado. El objetivo de este trabajo es analizar el patrón de metilación de gen ptpn6 en diversos tejidos y en tejido tumoral prostático, con el fin de verificar la hipótesis de que un cambio del patrón de metilación de la región promotora 1 podría estar provocando la disminución o pérdida de la expresión de este gen en carcinomas avanzados de próstata. Una alternativa para conocer en detalle el estado de metilación del promotor es la secuenciación bisulfito en la que se busca modificar específicamente las C no metiladas, que se transforman en U, mientras que las C metiladas ubicadas en las islas CG no sufren ninguna modificación. Para la puesta a punto del método se tomaron 9 muestras de sangre y mucosa yugal provenientes de personas sanas, se extrajo el DNA y se realizó el tratamiento con bisulfito para cada una. Simultáneamente se diseñaron 4 cebadores específicos que hibridan dentro promotor 1, en zonas libres de islas CG, abarcándolo por completo desde +10 hasta -1200. Para la puesta a punto de la amplificación se trabaja con un esquema de ciclado de varios segmentos con Tm decrecientes y con amplificación de tipo “touch down”. Un vez amplificado el promotor tratado con bisulfito, el diseño experimental comprende su clonación en el vector pGEM-T para su posterior secuenciación. Esto permitirá establecer el patrón de metilación del promotor 1 relacionado con la expresión de PTPN6 en células hematopoyeticas y epiteliales, y posteriormente comparar este patrón con el que muestren las células epiteliales prostáticas normales y tumorales.