PUESTA A PUNTO DE UNA TÉCNICA DE PCR CON BLANCO EN EL PROMOTOR DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL-alfa HUMANO.

QUINTERO, MI; CABRERA, MED; TONON, SA; LIOTTA, DJ; BADANO, I

Posadas

Jornada; II Jornadas Nacionales de Estudiantes de Biología; 2007

Asociación de Estudiantes de Biología

INTRODUCCION El Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a) es una de las principales citoquinas involucradas en la resolución de infecciones por patógenos. Se han descripto polimorfismos para un único nucleótido (SNPs) en la región promotora del gen, los cuales tendrían la capacidad de modificar sus niveles de trascripción y por lo tanto disponibilidad celular. En el presente trabajo se realizó la puesta a punto de una técnica de PCR para amplificar un segmento de esta región reguladora. El desarrollo de esta técnica sienta las bases para futuros estudios de variabilidad genética en esta región promotora. OBJETIVOS 1.Poner a punto una técnica de PCR con blanco en un fragmento de la región promotora del TNF-a humano. MATERIALES Y MÉTODOS Las condiciones de reacción de PCR fueron determinadas partir del Tm de los primers (rango 58-62ºC), el tamaño del fragmento esperado (722bp) y titulación de Cl2Mg (rango de 1mM a 3,5mM). Como blanco de reacción se empleó ADN extraído de células humanas, y como control negativo agua. La confirmación del producto de PCR fue mediante restricción enzimática y secuenciación. RESULTADOS En base a los parámetros considerados las condiciones óptimas de ciclado fueron: desnaturalización inicial de 95ºC 5´; 40 ciclos de 95ºC 1´, 61ºC 1´ y 72ºC 1´. Las reacciones contenían Buffer PCR1X (Invitrogen), 1,5mM Cl2Mg, 75pmoles de cada primer, 200uM de cada dNTP, y 2U de Taq polimerasa. Los amplicones fueron resueltos mediante electroforesis en gel de agarosa 1,5% teñidos con bromuro de etidio. Un fragmento de 722 pb indicó amplificación positiva. La secuencia fue confirmada mediante restricción enzimática con EcoRI y secuenciación. CONCLUSIONES: El desarrollo de tecnologías de manipulación del ADN, como la PCR, restricción enzimática y la secuenciación, han facilitado el análisis de marcadores genéticos humanos. La ejecución del presente trabajo permitió poner a punto una técnica de PCR con blanco en un segmento de la región promotora del TNF-a humano. El éxito obtenido permitirá extender nuestras investigaciones al estudio de variabilidad genética de esta región reguladora y su potencial relación con el desarrollo de algunas enfermedades infecciosas.ENTIDAD FINANCIERA: International Society for Infectious Diseases.