CDKA y ciclina D6 de maíz: clonado y producción de proteína recombinante

ME VINACOUR; CL MATAYOSHI; AAE MENDEZ; N GOMEZ MANSUR; L PENA; E GARCIA RAMIREZ; JM VAZQUEZ RAMOS; S GALLEGO

Simposio; X Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO Argentina 2015; 2015

La disminución delcrecimiento vegetal es uno de los principales síntomas visibles en plantassometidas a condiciones ambientales desfavorables, pudiendo afectar lasupervivencia y/o la productividad de las mismas. Dentro de los factores que rigenel crecimiento se encuentra la proliferación, proceso conducido por el ciclocelular, cuya bioquímica depende de la actividad de kinasas dependientes deciclinas (CDKs) y de sus activadores específicos, las ciclinas. Los complejosformados entre la CDKA y las ciclinas de tipo D (CycD) son responsables de latransición G1-S que pone en marcha la división celular. En nuestro laboratoriodemostramos que varios factores abióticos pueden alterar el equilibrio redoxcelular conduciendo a la generación de estrés oxidativo. En particular,asociamos las modificaciones postraduccionales (MPT) de tipo oxidativas de lasproteínas CDKA y CycD con interrupción de la fase G1-S como parte del mecanismode detención del crecimiento vegetal. El objetivo de nuestra investigación esestudiar la sensibilidad y/o sitios posibles de sufrir MPT oxidativas de laCDKA y las CycD para poder evaluar si estas MPT alteran la interacciónCDKA/CycD o modifican sitios blanco de otras MPT. En este trabajo presentamosresultados bioinformáticos y el comienzo de la optimización de la producción deproteínas recombinantes. Para ello, a partir de ARNm obtenido de ejesembrionarios de maíz (Zea mays L.) variedad Chalqueño, se clonaron lassecuencias codificantes de CDKA y de CycD6 en pGEX-4T2, que luego fueronintroducidos en Escherichia coli cepa BL21. Las secuencias clonadas secontrolaron por secuenciación por electroforesis capilar. Mediante análisisbioinformáticos se compararon las secuencias codificantes (nucleótidos yaminoácidos) de referencia y clonadas, se realizaron predicciones de dominios(http://www.ebi.ac.uk/interpro/), de MPT (http://www.expasy.org/), estructurasecundaria y terciaria donde se ubicaron aminoácidos susceptibles a oxidación(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2). Con el fin de optimizar la producción deproteína se compararon producciones en la cepa BL21 y en la cepa Rosettagami(DE3)pLysS en medio de cultivo Luria-Bertani (LB), siendo BL21 la cepaelegida para producir CDKA y Rosetta para la producción de CycD6. El uso de2xLB no mejoró la producción de proteína, al igual que el enriquecimiento delmedio de cultivo con dos fuentes de C diferentes: glucosa y glicerol. No sedetectó fragmentación de las proteínas, tanto por proteasas como por el procesode congelado/descongelado. Si bien parte de la producción bacteriana seencuentra en forma soluble en el citoplasma celular, una gran cantidad deproteína permanece formando parte de cuerpos de inclusión, por este motivo fuenecesario la recuperación de las proteínas de los mismos.Entendemos que comprenderlos mecanismos que alteran la funcionalidad de proteínas implicadas en elcrecimiento vegetal nos permitirá mejorar la comprensión de los procesos quecomunican la maquinaria del ciclo celular con las señales internas de la célulay los agentes externos, aportando al conocimiento de los mecanismos que alteranel crecimiento de las plantas y abriendo nuevas perspectivas en la selección eingeniería de plantas para mejorar los cultivos de interés agroalimentario.