INVESTIGADORES
NUSBLAT alejandro David
congresos y reuniones científicas
Título:
Identificación de genes del metabolismo de esteroles en el ciliado Tetrahymena mediante análisis bioinformático y noqueo somático
Autor/es:
NUSBLAT AD; TOMAZIC ML; NAJLE SR; RINALDI MA; UTTARO A; NUDEL CB
Lugar:
Santa Fe, Argentina
Reunión:
Congreso; XXIII Reunión Científica Anual, Sociedad Argentina de Protozoología; 2009
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Protozoologia
Resumen:
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Identificación de genes del metabolismo de esteroles
en el ciliado Tetrahymena mediante análisis
bioinformatico y noqueo somático.
A.
D. Nusblat1, M. L. Tomazic1,
S. R. Najle2, M. A. Rinaldi1,
A. D. Uttaro2 y C. B. Nudel1.
1 Cátedra
de Biotecnología y Microbiología Industrial, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113 Buenos Aires, Argentina.
2 Departamento de Microbiología. Instituto de Biología Molecular y
Celular de Rosario (IBR-CONICET). Suipacha 531. S2002LRK, Rosario. Argentina.
Las enzimas que
intervienen en el metabolismo de esteroles se encuentran ampliamente
distribuidas y presentan estructuras primarias altamente conservadas. Los
intermediarios y productos de estas vías modulan la fluidez de membranas y cumplen
funciones metabólicas y de señalización. intra e intercelular en todos los
organismos eucariotas.
No todos los
organismos poseen las enzimas intervinientes de la vía completa de síntesis de
esteroles. Este es el caso de organismos invertebrados como nematodos e
insectos y varios protozoarios como los ciliados.
El requerimiento
de esteroles entre los ciliados es irregular. Por ejemplo, Paramecium tetraurelia
requiere esteroles para su desarrollo vegetativo. En cambio Tetrahymena satisface este requerimiento
sintetizando hopanoides (símil esteroles encontrados en bacterias), principalmente el tetrahymanol, con el que
regula la fluidez y permeabilidad de las membranas, en conjunto con los ácidos
grasos. La capacidad de ciertos ciliados de sintetizar y usar hopanoides puede
ser una reliquia metabólica, remanente de los tiempos en que la atmósfera era
anaerobia, ya que, a diferencia de los esteroles, su síntesis no requiere
oxigeno molecular.
Si bien Tetrahymena carece
de la capacidad de sintetizar esteroles, cuando estos se agregan en el medio de
cultivo se interrumpe inmediatamente la síntesis de tetrahymanol y el esterol
adicionado es incorporado y, en ciertos casos, también modificado. Se han detectado
cuatro tipos de modificaciones posibles: la introducción de dobles enlaces en posiciones
C5(6), C7(8) y C22(23) y la remoción del grupo etilo del carbono 24.
Ninguna de las enzimas
responsables de estas transformaciones han sido aisladas.
A partir de una caracterización
preliminar de las actividades C7(8) y C22(23) esterol desaturasas, en
fracciones microsomales, se determinaron sus requerimientos de oxigeno, NAD(P)H
y Cytb5. La búsqueda informática
de un consenso de esterol desaturasas Cytb5
dependientes reveló 8 genes putativos en el genoma de Tetrahymena.
El análisis de
las hipotéticas secuencias proteicas las agrupa dentro de la superfamilia de
hidroxilasas de ácidos grasos, que incluyen las C5 esterol desaturasas, C4
metil oxidasas y C4 esfingolipido hidroxilasas. Estas enzimas tienen motivos
conservados de histidina y son proteínas integrales de membrana.
Con el fin de
identificar los genes responsables del metabolismo de esteroles en Tetrahymena thermophila se procedió a
generar mutantes mediante noqueo somático por precombinación homologa. Para ello
se realizaron construcciones por overlapping PCR, consistentes en un gen
marcador seleccionable y regiones homologas flanqueantes de cada uno de los
genes a noquear.
De esta forma se
pudo identificar dos de estos genes como correspondientes a C5(6) esterol desaturasa y C24 esterol deeetilasa.
La caracterización de las
mutantes noqueadas revelo aspectos muy distintos de ambos genes. Mientras que
la mutante noqueada en C5(6) no tiene ningún fenotipo apreciable ni se afecta su
crecimiento, tanto en rendimiento de biomasa como velocidad de crecimiento, la
mutante noqueada en la actividad deetilasa sufre significativos cambios en
ambos parámetros, también visibles en la morfología aparente.
Ambas mensajeros se transcriben
en ausencia de esteroles, según indicaron los ensayos de RT-PCR. Tampoco seria
necesario la instauración en C7(8) para la introducción del doble enlace en C5,
a diferencia de lo observado en otros eucariontes analizados.
Estos son los primeros dos genes
del metabolismo de esteroles identificados en ciliados. Mas aun, el gen
correspondiente a la enzima deetilasa no ha sido encontrada en ningún
organismo.