Secuenciación de Nueva Generación como herramienta para la caracterización de eventos transgénicos de trigo

GARIBOTTO MB; VERA P; MUÑOZ M; BEZNEC A; CARIGNANO HA; PUEBLA A; BOSSIO E

Simposio; XIII SIMPOSIO REDBIO ARGENTINA 2021; 2021

El objetivo del presente trabajo es obtener información detallada a nivel molecular ygenómico para el screening y selección de eventos transgénicos de poblaciones de trigopan. De este análisis se obtendrá información sobre las zonas flanqueantes a lasinserciones, la cual permitirá el diseño de oligonucleótidos específicos. Además, sedeterminará el número de inserciones y su localización dentro del genoma.Actualmente se utiliza la técnica Southern Blot o el caminado cromosómico para lacaracterización molecular de eventos transgénicos. Sin embargo, la complejidad y losaltos costos de dichas técnicas representan una dificultad a la hora de analizar grandespoblaciones de especies con genomas poliploides y complejos, como el del trigo pan.En este trabajo se puso a punto una novedosa técnica para la identificación de regionesflanqueantes a las inserciones en eventos transgénicos de trigo pan, utilizando elenriquecimiento de una secuencia blanco, combinada con secuenciación masiva.Partiendo del vector de transformación utilizado para obtener el evento transgénico, sediseñaron sondas biotiniladas. Estas sondas se emplearon para la captura yenriquecimiento de las regiones de interés de una biblioteca de ADN genómico,previamente construida a partir del ADNg del trigo transformado. Luego de la captura, labiblioteca enriquecida fue secuenciada por secuenciación masiva.El análisis bioinformático de las secuencias obtenidas, altamente enriquecidas en lasecuencia de interés, permitió encontrar diferentes combinaciones de inserciones en loscromosomas analizados: pares discordantes, secuencias de unión y la combinación deambas. A partir de esta información, se identificaron 36 sitios calientes distribuidos en 19de los 21 cromosomas de trigo, siendo cuatro de estos los más promisorios. Estos sitioscalientes representan loci potenciales en los que pudo haberse insertado el transgén.Para cada uno de los locus promisorios, distribuidos en tres cromosomas, se diseñó unaserie de oligonucleótidos específicos utilizando una base de datos de referencia(GrainGenes, GSP), mediante los cuales se verificará la presencia del transgén.