Inducción in vitro de callos de Citrus sinensis para la utilización en experimentos de edición de genes de susceptibilidad a HLB

FERREYRA CORDERO LUCRECIA; MUSSO FEDERICO OMAR; GIMENEZ PAULA D.; GOCHEZ ALBERTO M.

Concordia

Congreso; X Congreso Argentino de Citricultura; 2023

La enfermedad de Huanglongbing (HLB) también conocida como Greening o “enverdecimiento de loscítricos” es considerada una de las enfermedades más destructivas de este cultivo en el mundo. Afecta acasi todas las variedades de cítricos, siendo las toronjas, naranjas dulces, algunos tangelos y mandarinaslas más susceptibles y las limas, limones, naranjas agrias y naranjas trifoliadas las menos. Desarrollos tecnológicos recientes de edición genómica tienen el potencial de facilitar la producción de cultivares de cítricos genéticamente modificados pero que carezcan de transgenes. Las tecnologías de edición genómicabasadas en CRISPR/Cas9-single guide RNA (Cas9-sgRNA) contra genes de susceptibilidad de la planta alagente causal de la enfermedad, Candidatus liberbacter spp., ofrecen una alternativa para la obtención detolerancia. En el presente trabajo se indujeron callos in vitro a partir de diferentes explantos provenientesde las variedades Pineapple y Valencia late de Citrus sinensis. Se extrajeron segmentos internodales deplantines cultivados en invernadero de aproximadamente un año de la variedad Pineapple y se cultivaronen medio MS adicionado con las hormonas vegetales ANA (10 mg/L) y BAP (0.25 mg/L) hasta el desarrollode callos (entre 2 y 3 semanas) con fotoperíodo 16/8. Los mismos se desprendieron de los segmentos y secultivaron en placa durante aproximadamente 10 semanas de manera de establecer líneas individuales delas que se observó morfología, color y cinética de crecimiento. De las líneas obtenidas se seleccionaron 3,se disgregaron los callos y se sub-cultivaron en medio líquido con la misma composición de hormonas. Lascélulas se observaron al microscopio registrándose características morfológicas normales. Para el caso deltejido nucelar se utilizaron frutos de campo verdes inmaduros de 12 a 14 semanas y de aproximadamente5 cm de diámetro de la variedad Valencia late. Se procedió a extraer el tejido nucelar de las semillas y antes de ser cultivadas se extrajeron los embriones zigóticos. El tejido nucelar se creció en medio MS suplementado con extracto de malta con y sin el agregado de BAP (3mg/L) y ANA (10mg/L). Los explantos fueron crecidos en oscuridad por 6 a 8 semanas hasta la aparición de callos. Los mismos fueron separados ysub-cultivados en medio líquido con la misma composición. Al presente se cuenta entonces con líneas decallos derivados de estos dos tipos de explantos que serán utilizados para la transformación estable y/otransitoria con los componentes necesarios para la edición genética de genes de susceptibilidad a HLB.