Generación de construcciones para la edición por CRISPR/Cas9 de genes de susceptibilidad a Huanglongbing en Citrus sinensis.

FERREYRA CORDERO LUCRECIA; MUSSO FEDERICO OMAR; MASSA GABRIELA A.; DECIMA ONETO CECILIA A.

Ciudad Autonoma de Buenos Aires

Simposio; "Biotecnología para un mundo en cambio" XIV SIMPOSIO REDBIO ARGENTINA; 2023

Argentina es uno de los principales productores de cítricos a nivel mundial, siendo unode los cultivos más importantes del país. El Huanglongbing (HLB) es una enfermedaddevastadora globalmente que pone en peligro toda la producción y el valor económicode las plantaciones. El agente asociado a la enfermedad es la bacteria CandidatusLiberibacter asiaticus (CLas), y una vez que el árbol está infectado, no tiene cura. Elpresente trabajo se enmarca en un proyecto que apunta a dar una solución sustentablea la inminente pérdida de plantaciones de cítricos por HLB, centrándose en la prevenciónde la diseminación de la enfermedad. Se propone como estrategia la edición de genesde susceptibilidad de Citrus sinensis (naranjo dulce) a la bacteria causante de laenfermedad mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Se pretende editar un gen desusceptibilidad a HLB previamente reportado, CsA del genoma de C. sinensis, así comotambién otros dos genes de susceptibilidad candidatos: CsB y CsC. El objetivo final esobtener líneas knock-out para sendos genes. Para tal fin se han diseñado y seleccionadomediante herramientas bioinformáticas las mejores moléculas de RNA guías (sgRNAs)para cada uno de los genes de acuerdo a su secuencia, estructura óptima deplegamiento y riesgo de off-targets. Éstas sgRNAs fueron sintetizadas e introducidas envectores utilizando un sistema de clonado de dos niveles de tipo Golden Gatedesarrollado por Voytas Lab. En el primero de los niveles se ensamblaron los módulosde expresión para las sgRNAs bajo el control del promotor U6, óptimo para dirigir latranscripción de moléculas cortas de RNA, la secuencia especifica de la sgRNA diseñaday una secuencia conservada denominada scaffold en posición downstream que esesencial para otorgar la estructura tridimensional de la molécula y permitir la interaccióncon la enzima Cas9. En el segundo nivel, se clonaron combinaciones de dos sgRNAs paraun mismo gen junto a un módulo para la expresión de la enzima nucleasa Cas9 y unmódulo que otorga resistencia a kanamicina como marcador de selección para latransformación genética de plantas vía Agrobacterium tumefaciens. Los vectoresobtenidos fueron verificados mediante mapas de restricción y por secuenciación. Seprevé utilizarlos para transformar segmentos internodales de C. sinensis con la cepaEHA105 de A. tumefaciens de manera estable y luego de la identificación ycaracterización de las ediciones, someter dichas líneas a ensayos de desafío conCandidatus liberibacter asiaticus para evaluar efectos de tolerancia o resistencia a laenfermedad.