Prototipo de ELISA sándwich basado en nanoanticuerpos para la detección de antígeno del Virus de la Hepatitis E de transmisión zoonótica

ARCE, L.P; MATIAS BRANCHER, JR; PAVAN, M.F; BOK, M.; PARREÑO, V; VIZOSO PINTO, M.G.; IBAÑEZ, L.I

Tandil

Jornada; AAIV 2022 - XIV Jornadas de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria - II Reunión de la Red Latinoamericana de Inmunología Veterinaria; 2022

El Virus de la Hepatitis E (HEV) es un virus zoonótico emergente causante de hepatitis aguda. La detección del antígeno de cápside (ORF2 glicosilada) que circula libre en plasma o de la partícula viral en heces permite diagnosticar la infección. Recientemente, obtuvimos nanoanticuerpos (VHHs) contra ORF2. Nuestro objetivo fue desarrollar un prototipo de inmunoensayo basado en VHHs para la detección de antígeno. ORF2 HEV-3 fue expresada en células HEK 293 y purificada mediante cromatografía de afinidad. Se seleccionaron 6 VHHs anti-ORF2 según la región determinante de hipercomplementariedad (CDR3) y se realizó la expresión, purificación y modificación con diferentes etiquetas (unión a plástico (VHHPSW) y unión a biotina (VHHbio)). La afinidad de los VHHs sin modificar se evaluó mediante ELISA indirecto, brevemente se sensibilizó con diferentes concentraciones de ORF2 (o.n. 4°C), bloqueo con leche 5 %, luego se añadió diferentes concentraciones de VHHs y finalmente se incubó con anti-HisHRP. Los VHHs con y sin modificaciones que presentaron mayor afinidad por la proteína, se usaron para un prototipo de ELISA sándwich para la detección de antígeno. Se probaron: tipo de placa y concentraciones variables de los siguientes reactivos: VHH, VHHPSW, agente bloqueante, ORF2 glicosilada, VHHbio y anticuerpo estreptavidina HRP. Los VHHs que presentaron mayor afinidad fueron los VHH11 y VHH18. Las condiciones preliminares para el ELISA sándwich fueron: concentración del VHHPSW 0,1 ig/ml, gelatina 1 %, VHHbio 1/200 y estreptavidina conjugada 1/10000. El límite de detección fue 100 ng/ml de ORF2 glicosilada. Desarrollamos un prototipo para detección de antígeno de HEV que luego de ser validado podrá ser usado en muestras de suero y heces para el diagnóstico y pronóstico de la infección por HEV. Esta herramienta es de utilidad para el control de la transmisión zoonótica del HEV-3.