Óptica adaptativa para nanoscopias de fluorescencia STED y RASTMIN

FLORENCIA EDORNA; FERNANDO D. STEFANI

Bariloche

Congreso; Reunión de la Asociación Física Argentina.; 2022

Asociación Física Argentina.

Las nanoscopías de fluorescencia (Premio Nobel de Química 2014)[1] aprovechan elcontrol fotoquímico o fotofísico de moléculas fluorescentes para hacer posible la visualización con resolución espacial más allá del límite de difracción[2]. Estas metodologíasno presentan un límite fundamental en la resolución que pueden alcanzar, el límite espráctico, tecnológico. Las nanoscopías de fluorescencia STED[1] y RASTMIN[3], sibien se basan en principios de funcionamiento diferentes, ambas requieren de iluminar la muestra con patrones de luz bien definidos, que incluyen mínimos (idealmenteceros) de intensidad obtenidos por interferencia destructiva. Debido al alto nivel deresolución alcanzado, no sólo son relevantes las aberraciones que produce el espécimen, especialmente a medida que aumenta el espesor, sino también las aberracionesdel instrumental. La óptica adaptativa es la manera más eficiente de corregir aberraciones de manera dinámica y permitir que un nanoscopio de fluorescencia alcance supoder nominal.En el campo de la astronomía, a partir de la década de 1950 se comenzó a desarrollarel concepto de óptica adaptativa, que consiste en compensar las variaciones de faseintroducidas por la atmósfera de modo de obtener una imagen sin distorsiones. Losavances en computación a partir de 1990 hicieron que la óptica adaptativa fuese practicable. Más recientemente, se comenzó a aplicar óptica adaptativa en microscopíaóptica, en particular para inspeccionar especímenes biológicos que presentan naturalmente variaciones de índice de refracción[4]. El enfoque a aplicar consiste en tomarmediciones de la PSF (point-spread function) del microscopio, ya sea en la excitacióno en la detección, y se corrige el camino correspondiente aplicando una máscara defase que compense las distorsiones incorporadas por la muestra. Se evalúa el frente de ondas y el tipo de aberración presente en términos de polinomios de Zernikepara compensar las mismas[5]. En el caso de nanoscopías de barrido como STED, las aberraciones son más relevantes en la iluminación, ya que en estos métodos laubicación de los fluoróforos se realiza mediante una iluminación espacialmente modulada. Existen reportes de mejoras de STED usando óptica adaptativa para compensaraberraciones tanto en el haz de excitación como en el de depleción[6]. En el caso deRASTMIN al ser una técnica más reciente, no existen antecedentes del uso de ópticaadaptativa.La modulación controlada del frente de onda del haz óptico tiene muchas aplicaciones,como pueden ser en óptica adaptativa, procesamiento óptico de datos o en holografía.Para las aplicaciones en nanoscopía de fluorescencia, lo esencial es la modulación defase para obtener focos de luz estructurados o para corregir aberraciones producidasen la muestra. Para su realización se utiliza un modulador espacial de luz que esun dispositivo que permite modificar la intensidad y/o la fase del campo eléctricode un haz óptico en distintas posiciones transversales del haz. En los moduladoresbasados en cristales líquidos (Spatial Light Modulator, SLM)[7] cada píxel consisteen una celda de cristal líquido que puede alinearse mecánicamente con la aplicaciónde voltaje, aprovechando sus propiedades de anisotropía óptica, lo que hace que seanbirrefringentes. Esta inclinación cambia el índice de refracción de las moléculas lo queprovoca una longitud de trayectoria óptica modificada.Referencias[1]Hell, S. W. Nanoscopy with Focused Light (Nobel Lecture). Angew. Chemie Int.Ed. 54, 8054?8066 (2015).[2]Hell, S. W. Microscopy and its focal switch. Nat. Methods 6, 24?32 (2009).[3]Masullo et al. ?An alternative to MINFLUX that enables nanometer resolution ina confocal microscope?. Light: Science Applications 11 (2022) 199.[4]Adaptive Optics for Biological Imaging. (CRC Press, 2013). doi:10.1201/b14898-11.[5]William C. Sweatt. Reduction of Zernike wavefront errors using a micromirror array.Optical Engineering 44(9), 098001 (1 September 2005). https://doi.org/10.1117/1.2048367.[6]Patton, B. R. et al. Three-dimensional STED microscopy of aberrating tissue usingdual adaptive optics. Opt. Express 24, 8862 (2016).[7]Schad, Martin. Liquid crystal materials an liquid crystal displays. Annu. Rev. Mater.Sci. 1997. 27:305?79.